ENT1參與癲癇發(fā)作的功能及機制研究.pdf

1、第一部分ENT1在顳葉癲癇患者及點燃動物模型中的表達(dá)
　　 目的:觀察ENT1在難治性顳葉癲癇患者顳葉腦組織的表達(dá)及氯化鋰-匹魯卡品點燃癲癇大鼠海馬中的時空表達(dá)關(guān)系。
　　 方法:
　　 1.病人:用隨機的方法從課題組收集并建立的難治性顳葉癲癇患者術(shù)后腦組織庫中抽取15例腦組織，用Weatern blot方法檢測ENT1的表達(dá)，并與15例年齡、性別匹配的腦外傷組織標(biāo)本進(jìn)行對照。
　　 2.動物:將雄性成年

2、SD大鼠（體重200 g左右）隨機分為正常對照組(n=5)與癲癇組（6h、24 h、72 h和1w四個時間點，n=5×4），經(jīng)腹腔注射氯化鋰-匹魯卡品，建立癲癇實驗動物模型，用Weatern blot、免疫組化及免疫熒光檢測ENT1在癲癇患者顳葉和癲癇鼠海馬組織中表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.通過Western blot檢測，顯示外傷患者的腦組織及難治性顳葉癲癇患者的腦組織中ENT1均有表達(dá)，然而，在癲癇患者的腦組織中

3、ENT1的免疫印跡強度明顯增強(1.18±0.15)，與非癲癇患者(0.50±0.10)相比較，其蛋白含量的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 2.通過Western blot檢測，顯示正常組的大鼠海馬組織中檢測到ENT1有基礎(chǔ)水平的表達(dá);在匹羅卡品誘發(fā)的癲癇大鼠海馬組織中，在癲癇發(fā)作后的6h的標(biāo)本就發(fā)現(xiàn)ENT1的水平升高，24 h達(dá)到高峰，且在72 h和1w這兩個時間點的蛋白量水平仍處于升高水平。在癲癇組中所檢測到的各個時間點的ENT1

4、的蛋白含量與正常對照組的相比較，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義;此外，通過免疫組化和免疫熒光雙重標(biāo)記技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在癲癇大鼠海馬中，ENT1在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞漿內(nèi)均有表達(dá)。
　　 結(jié)論:在癲癇患者腦組織和實驗大鼠點燃模型海馬中ENT1的蛋白表達(dá)水平均明顯升高，該情況提示ENT1可能參與了癲癇的發(fā)生與發(fā)展過程。
　　 第二部分在體實驗檢測ENT1在大鼠癲癇發(fā)作中的功能
　　 目的:了解抑制ENT1對實驗大鼠癲癇樣行為學(xué)的影

5、響。
　　 方法:將ENT1選擇性抑制劑硝基苯硫嘌呤核苷（50μM）及其溶劑二甲亞砜，通過立體定位及微管將其注射入大鼠雙側(cè)海馬CA1區(qū)，觀察硝基苯硫嘌呤核苷抑制ENT1后對大鼠癲癇發(fā)作的影響情況。
　　 1.成年雄性SD大鼠，隨機分為正常對照(Control)組(n=9)、溶劑對照(vehicle)組(n=9)和硝基苯硫嘌呤核苷組(n=9);各組在腹腔注射匹魯卡品前分別微管注射生理鹽水、二甲亞砜及硝基苯硫嘌呤核苷。

6、>　　 2.腹腔注射匹魯卡品后建模，觀察首次癲癇發(fā)作的潛伏期改變及不同時間段Racine評分的情況。
　　 結(jié)果:Racine評分達(dá)到4級及以上者視為癲癇發(fā)作，正常對照組的潛伏期為24.56±5.83 min，溶劑對照組的為23.89±5.93 min，硝基苯硫嘌呤核苷組的為55.89±8.74 min，Racine評分在注射匹羅卡品后10min、20 min及30 min三個時間點，正常對照組分別2.67±0.50、3.67

7、±0.50及4.78±0.44;溶劑對照組分別為2.56±0.53、3.89±0.60及4.78±0.44;硝基苯硫嘌呤核苷組分別為0.67±0.50、1.78±0.44及2.89±0.33。潛伏期及Racine評分于正常對照及溶劑對照兩組之間的比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與上述兩組比較，硝基苯硫嘌呤核苷組的潛伏期明顯延長，且大鼠腹腔注射匹魯卡品后個時間點的Racine評分明顯降低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論:有效劑量硝基苯硫

8、嘌呤核苷干預(yù)可明顯明顯延長匹魯卡品誘導(dǎo)的大鼠癲癇發(fā)作潛伏期以及降低癲癇發(fā)作強度，換言之，選擇性抑制ENT1功能，可以有效地抑制實驗大鼠的癲癇發(fā)作。
　　 第三部分離體實驗檢測ENT1在癲癇大鼠海馬腦片中的功能
　　 目的:通過全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，觀察癲癇大鼠海馬腦片電生理學(xué)指標(biāo)的變化以及ENT1選擇性抑制劑硝基苯硫嘌呤核苷的干預(yù)情況，探討ENT1在抗癲癇發(fā)作中的作用。
　　 方法:制備成年大鼠海馬腦片，隨機選擇正常

9、成年大鼠及造模成功的癲癇大鼠（根據(jù)第一部分實驗結(jié)果，選擇ENT1表達(dá)高峰的時間點24 h的模型鼠），癲癇大鼠海馬腦片每個指標(biāo)檢測完之后，均需灌流ENT1選擇性抑制劑硝基苯硫嘌呤核苷(100nM)。全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測正常鼠及癲癇鼠海馬腦片的興奮性改變情況:動作電位，計算其頻率的變化情況;進(jìn)而檢測誘發(fā)的總的興奮性突觸后電流及NMDA和AMPA受體介導(dǎo)的興奮性突觸后電流，觀察其幅值的的變化情況;最后檢測自發(fā)的微小的興奮性突觸后電流，檢測其頻

10、率和幅值的改變情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功制備適于膜片鉗全細(xì)胞記錄的成年大鼠海馬腦片。
　　 2.計算動作電位頻率:正常大鼠海馬腦片可偶爾記錄到動作電位的產(chǎn)生，癲癇大鼠海馬腦片的動作電位頻率明顯加快(125±8.86/min)，經(jīng)過灌流100nM硝基苯硫嘌呤核苷后，動作電位頻率明顯減弱，再次使用人工腦脊液洗脫后，動作電位頻率回升顯著。此外，100nM硝基苯硫嘌呤核苷也可使得單位時間內(nèi)，相同強度的注入電流所

11、誘發(fā)出來的動作電位個數(shù)減少。
　　 3.檢測硝基苯硫嘌呤核苷模擬腺苷的作用:.與正常大鼠海馬腦片（0.49±0.06 nA）相比，總的興奮性突觸后電流的幅值明顯升高。灌流腺苷(25μM)可以明顯降低總的興奮性突出后電流的幅值，然而，加入腺苷A1受體抑制劑DPCPX(10μM)又可以使得幅值回升。100nM硝基苯硫嘌呤核苷可以模擬腺苷的作用。此外，腺苷對總的興奮性突觸后電流的抑制作用是濃度依賴性的。在50μM腺苷作用時，對總的興奮

12、性突出后電流的抑制更強，再加入100nM硝基苯硫嘌呤核苷后，抑制作用有疊加的效果。然而，當(dāng)腺苷的濃度達(dá)到飽和時(100μM)，再加入100nM硝基苯硫嘌呤核苷后，卻未再見到疊加效果。
　　 4.檢測硝基苯硫嘌呤核苷抑制興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的作用:同正常鼠腦片相比較，自發(fā)的微小興奮性突觸后電流的頻率和幅值以及NMDAR和AMPAR介導(dǎo)的電流在癲癇鼠的腦片中均明顯升高。100nM硝基苯硫嘌呤核苷可以明顯減弱癲癇鼠腦片的自發(fā)的微小興奮性突觸

13、后電流的頻率，但是對幅值卻無明顯影響。為進(jìn)一步確定是NMDAR還是AMPAR介導(dǎo)的作用，發(fā)現(xiàn)使用100nM硝基苯硫嘌呤核苷可以減弱癲癇鼠腦片的NMDAR和AMPAR介導(dǎo)興奮性突出后電流的幅值。
　　 結(jié)論:
　　 1.硝基苯硫嘌呤核苷可降低癲癇大鼠海馬腦片CA1區(qū)錐體神經(jīng)元的動作電位頻率，選擇性抑制ENT1功能，可以有效降低癲癇大鼠海馬離體腦片的神經(jīng)元的興奮性。
　　 2.硝基苯硫嘌呤核苷對興奮性突觸后電流的影響

14、是通過腺苷A1受體介導(dǎo)的，選擇性抑制ENT1功能，是通過抑制腺苷A1受體的功能而抑制神經(jīng)元興奮性。
　　 3.硝基苯硫嘌呤核苷選擇性地抑制自發(fā)性的微小興奮性突觸后電流頻率以及NMDAR和AMPAR介導(dǎo)的興奮性突出后電流，提示選擇性抑制ENT1功能，是通過影響突觸前結(jié)構(gòu)谷氨酸能神經(jīng)遞質(zhì)的釋放而起效。
　　 第四部分探究ENT1參與癲癇發(fā)作的潛在機制
　　 目的:探討ENT1參與癲癇發(fā)作的潛在機制。
　　 方

15、法:將ENT1選擇性抑制劑硝基苯硫嘌呤核苷（NBTI，50μM）及其溶劑二甲亞砜(DMSO)和生理鹽水，通過立體定位及微管將其注射入大鼠雙側(cè)海馬CA1區(qū)，觀察硝基苯硫嘌呤核苷抑制ENT1后對cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)磷酸化水平的影響情況。
　　 1.選擇成年雄性SD大鼠（200 g左右），隨機分為正常對照組(n=5)、癲癇組(24 h)(n=5)、DMSO組(n=5)及NBTI組(n=5)。
　　 2.Weat

16、ern blot檢測CREB磷酸化水平在上述不同組別海馬組織中的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果:癲癇大鼠海馬內(nèi)的CREB磷酸化水平（1.05±0.11）較正常大鼠(0.44±0.06)的明顯增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.01)。提前海馬內(nèi)注射50μM NBTI，再將大鼠腹腔內(nèi)注射皮羅卡品建癲癇模型，可發(fā)現(xiàn)海馬內(nèi)的CREB磷酸化水平（0.47±0.07）明顯被抑制，與癲癇組的磷酸化水平相比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。此外，提前海馬內(nèi)注射溶劑D