褪黑素改善慢性癲癇大鼠認知功能及其機制研究.pdf

1、研究背景
　　癲癇是一種以大腦神經(jīng)元異常同步放電為表現(xiàn)的常見神經(jīng)系統(tǒng)疾病,放電過程常伴認知和行為功能的嚴重損傷。癲癇患者的認知功能損害主要包括學(xué)習(xí)能力下降,記憶力減退,智力水平低下等。流行病學(xué)資料顯示,近40％癲癇患者存在認知功能障礙,且癲癇發(fā)作及其治療均對認知功能的發(fā)展與維持均有不同程度的影響。目前針對癲癇患者認知功能障礙無確切有效的治療手段,因此預(yù)防癲癇患者認知障礙已成為當(dāng)前癲癇研究領(lǐng)域的熱點。
　　褪黑素是5-HT的衍

2、生物,也是一種松果體激素,以往臨床實驗觀察發(fā)現(xiàn)褪黑素對記憶力、智力有一定促進作用,同時癲癇、糖尿病等疾病的動物模型應(yīng)用褪黑素后其相對空間記憶的損害有一定保護作用,但關(guān)于褪黑素與認知其他相關(guān)的行為學(xué)、電生理、分子生物學(xué)的研究尚處空白。
　　突觸可塑性是研究學(xué)習(xí)記憶機制公認的模型,所謂突觸可塑性即神經(jīng)元之間突觸性連接的變化,包括突觸效能的增強或減弱、受體蛋白分布、突觸后信號傳導(dǎo)機制的改變和神經(jīng)元間突觸分布的數(shù)量變化等。LTP(長時程增

3、強)是其表現(xiàn)形式之一。LTP誘發(fā)后會引發(fā)一系列基因表達,蛋白合成,其中較為關(guān)鍵的步驟是AMPA受體穿膜活動,AMPA受體表達位置及表達數(shù)量等動態(tài)變化均影響海馬區(qū)記憶過程。AMPARs亞基之一GluR2對AMPARs的生物物理特性具有重要影響,包括受體的動力學(xué),信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)、鈣離子的通透性等。以往研究已表明LTP誘發(fā)后GluR2在突觸膜上表達量增高,而癲癇后突觸膜上AMPARs的表達及LTP誘發(fā)情況等相關(guān)研究鮮有報道。
　　研究目的

4、
　　本實驗研究的主要目的是通過收集病例了解臨床上癲癇患者認知功能障礙情況,基礎(chǔ)實驗運用行為學(xué)實驗證實褪黑素是否具有認知保護性作用,同時通過檢測GluR2在海馬CA1區(qū)突觸膜上表達探索其可能的作用機制。
　　研究方法
　　1.癲癇患者認知功能障礙及其影響因素
　　采用韋氏兒童智力量表、成人智力量表對217例癲癇患者的認知功能進行測定。并分析發(fā)作頻率、發(fā)病年齡、發(fā)作時相、藥物使用情況等因素對認知的影響。
　　

5、2.褪黑素對慢性癲癇大鼠認知功能的影響研究
　　本部分實驗采用氯化鋰-匹羅卡品慢性癲癇大鼠模型。實驗大鼠隨機分為正常對照組、癲癇模型組、癲癇+褪黑素干預(yù)組、癲癇+生理鹽水干預(yù)組。各組隨機選擇3只大鼠在造模前安置腦電電極并于造模前一天至造模后第30天的長時程腦電監(jiān)測。癲癇模型的標(biāo)準為發(fā)作程度達到Racine評分4級或5級且發(fā)作持續(xù)時間達到70分鐘。安定終止后1小時褪黑素干預(yù)組(8mg/kg,腹腔注射)與生理鹽水組分別給予第一次腹腔注

6、射干預(yù)。之后連續(xù)給藥14d,每日一次,在此期間所有實驗大鼠每天均進行體重記錄。同時于造模后第10-30d進行自發(fā)性發(fā)作的視頻監(jiān)測,每天監(jiān)測12小時,并分析各組動物達到Racine發(fā)作4級和5級的次數(shù)和持續(xù)時間。因考慮發(fā)作因素對認知的影響,對視頻錄像中各組發(fā)作次數(shù)相當(dāng)?shù)拇笫?各組7只)進行亞組分組后再開始造模后第30天起的水迷宮工作記憶測試及電生理實驗。
　　3.褪黑素對慢性癲癇大鼠海馬區(qū)GluR2的表達影響
　　本部分實驗主

7、要通過westernblot實驗方法進行不同時間點不同區(qū)域各組間的比較。結(jié)果表明褪黑素對慢性癲癇大鼠模型GluR2在海馬總蛋白、海馬CA1區(qū)、CA1區(qū)突觸膜蛋白上的表達影響不同。
　　研究結(jié)果
　　1.癲癇患者認知功能障礙及其影響因素
　　資料分析顯示智力平常40例(18.5%)、智力低常51例(23.4%)、智力邊界45例(20.6%)、智力缺損81例(37.5%),217例癲癇患者中存在認知功能障礙者達177例(占

8、總?cè)藬?shù)81.5%)。同時發(fā)作頻率、發(fā)作時相,單藥-多藥療法均與認知損害程度相關(guān)。臨床資料統(tǒng)計證實癲癇患者中存在認知功能障礙的比例驚人,因此探索與研究對癲癇患者認知功能具有保護作用的藥物治療手段是臨床上迫切需要解決的問題。2.褪黑素對慢性癲癇大鼠認知功能的影響研究
　　2.1褪黑素干預(yù)組大鼠的自發(fā)性發(fā)作次數(shù)及持續(xù)時間、慢性期腦電圖每分鐘平均放電次數(shù)均較癲癇模型組及生理鹽水組有降低的影響趨勢,但無統(tǒng)計學(xué)顯著差異(P>0.05)。

9、>　　2.2挑選各組發(fā)作次數(shù)相當(dāng)?shù)膶嶒瀯游锾蕹园l(fā)性發(fā)作影響,褪黑素干預(yù)后對癲癇大鼠所致的工作記憶損傷具有一定保護作用,與模型組、生理鹽水組均有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。
　　2.3電生理實驗表明褪黑素干預(yù)后LTP誘導(dǎo)的水平低于正常對照組,但顯著高于模型組。
　　3.褪黑素對慢性癲癇大鼠海馬區(qū)GluR2的表達影響研究
　　3.1造模后1w、2w、4w、6w與正常對照組比較GluR2在海馬總蛋白的表達量隨時間遞減,

10、但尤以4w最為明顯。
　　3.2正常對照組、造模后4w及褪黑素干預(yù)組比較結(jié)果顯示褪黑素干預(yù)組GluR2在海馬總蛋白表達量顯著高于模型組,并有統(tǒng)計學(xué)差異;而與正常對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　3.3正常對照組、造模后4w及褪黑素干預(yù)組比較結(jié)果顯示正常對照組GluR2在海馬CA1區(qū)總蛋白的表達量較另兩組高,有統(tǒng)計學(xué)差異。褪黑素干預(yù)組及模型組間并無顯著差異。
　　3.4正常對照組、造模后4w及褪黑素干預(yù)組比較結(jié)果顯示正常對照

11、組及褪黑素組海馬CA1區(qū)突觸膜上GluR2表達量均高于模型組,有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　結(jié)論
　　褪黑素對于慢性癲癇大鼠的自發(fā)性發(fā)作相關(guān)指標(biāo)、腦電每分鐘平均放電次數(shù)及放電波幅均有降低影響趨勢,但同模型組在統(tǒng)計學(xué)上無顯著差異。剔除發(fā)作影響因素后,褪黑素可改善慢性癲癇大鼠的空間工作記憶,并且電生理相關(guān)實驗顯示褪黑素干預(yù)組LTP誘發(fā)水平高于癲癇模型組。后進一步通過westernblot實驗發(fā)現(xiàn)褪黑素干預(yù)組GluR2在海馬總蛋白及CA1區(qū)