褪黑素改善慢性癲癇大鼠認(rèn)知功能及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景
　　癲癇是一種以大腦神經(jīng)元異常同步放電為表現(xiàn)的常見神經(jīng)系統(tǒng)疾病,放電過程常伴認(rèn)知和行為功能的嚴(yán)重?fù)p傷。癲癇患者的認(rèn)知功能損害主要包括學(xué)習(xí)能力下降,記憶力減退,智力水平低下等。流行病學(xué)資料顯示,近40％癲癇患者存在認(rèn)知功能障礙,且癲癇發(fā)作及其治療均對(duì)認(rèn)知功能的發(fā)展與維持均有不同程度的影響。目前針對(duì)癲癇患者認(rèn)知功能障礙無確切有效的治療手段,因此預(yù)防癲癇患者認(rèn)知障礙已成為當(dāng)前癲癇研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。
　　褪黑素是5-HT的衍

2、生物,也是一種松果體激素,以往臨床實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)褪黑素對(duì)記憶力、智力有一定促進(jìn)作用,同時(shí)癲癇、糖尿病等疾病的動(dòng)物模型應(yīng)用褪黑素后其相對(duì)空間記憶的損害有一定保護(hù)作用,但關(guān)于褪黑素與認(rèn)知其他相關(guān)的行為學(xué)、電生理、分子生物學(xué)的研究尚處空白。
　　突觸可塑性是研究學(xué)習(xí)記憶機(jī)制公認(rèn)的模型,所謂突觸可塑性即神經(jīng)元之間突觸性連接的變化,包括突觸效能的增強(qiáng)或減弱、受體蛋白分布、突觸后信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制的改變和神經(jīng)元間突觸分布的數(shù)量變化等。LTP(長時(shí)程增

3、強(qiáng))是其表現(xiàn)形式之一。LTP誘發(fā)后會(huì)引發(fā)一系列基因表達(dá),蛋白合成,其中較為關(guān)鍵的步驟是AMPA受體穿膜活動(dòng),AMPA受體表達(dá)位置及表達(dá)數(shù)量等動(dòng)態(tài)變化均影響海馬區(qū)記憶過程。AMPARs亞基之一GluR2對(duì)AMPARs的生物物理特性具有重要影響,包括受體的動(dòng)力學(xué),信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)、鈣離子的通透性等。以往研究已表明LTP誘發(fā)后GluR2在突觸膜上表達(dá)量增高,而癲癇后突觸膜上AMPARs的表達(dá)及LTP誘發(fā)情況等相關(guān)研究鮮有報(bào)道。
　　研究目的

4、
　　本實(shí)驗(yàn)研究的主要目的是通過收集病例了解臨床上癲癇患者認(rèn)知功能障礙情況,基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)運(yùn)用行為學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)褪黑素是否具有認(rèn)知保護(hù)性作用,同時(shí)通過檢測GluR2在海馬CA1區(qū)突觸膜上表達(dá)探索其可能的作用機(jī)制。
　　研究方法
　　1.癲癇患者認(rèn)知功能障礙及其影響因素
　　采用韋氏兒童智力量表、成人智力量表對(duì)217例癲癇患者的認(rèn)知功能進(jìn)行測定。并分析發(fā)作頻率、發(fā)病年齡、發(fā)作時(shí)相、藥物使用情況等因素對(duì)認(rèn)知的影響。
　　

5、2.褪黑素對(duì)慢性癲癇大鼠認(rèn)知功能的影響研究
　　本部分實(shí)驗(yàn)采用氯化鋰-匹羅卡品慢性癲癇大鼠模型。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、癲癇模型組、癲癇+褪黑素干預(yù)組、癲癇+生理鹽水干預(yù)組。各組隨機(jī)選擇3只大鼠在造模前安置腦電電極并于造模前一天至造模后第30天的長時(shí)程腦電監(jiān)測。癲癇模型的標(biāo)準(zhǔn)為發(fā)作程度達(dá)到Racine評(píng)分4級(jí)或5級(jí)且發(fā)作持續(xù)時(shí)間達(dá)到70分鐘。安定終止后1小時(shí)褪黑素干預(yù)組(8mg/kg,腹腔注射)與生理鹽水組分別給予第一次腹腔注

6、射干預(yù)。之后連續(xù)給藥14d,每日一次,在此期間所有實(shí)驗(yàn)大鼠每天均進(jìn)行體重記錄。同時(shí)于造模后第10-30d進(jìn)行自發(fā)性發(fā)作的視頻監(jiān)測,每天監(jiān)測12小時(shí),并分析各組動(dòng)物達(dá)到Racine發(fā)作4級(jí)和5級(jí)的次數(shù)和持續(xù)時(shí)間。因考慮發(fā)作因素對(duì)認(rèn)知的影響,對(duì)視頻錄像中各組發(fā)作次數(shù)相當(dāng)?shù)拇笫?各組7只)進(jìn)行亞組分組后再開始造模后第30天起的水迷宮工作記憶測試及電生理實(shí)驗(yàn)。
　　3.褪黑素對(duì)慢性癲癇大鼠海馬區(qū)GluR2的表達(dá)影響
　　本部分實(shí)驗(yàn)主

7、要通過westernblot實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)不同區(qū)域各組間的比較。結(jié)果表明褪黑素對(duì)慢性癲癇大鼠模型GluR2在海馬總蛋白、海馬CA1區(qū)、CA1區(qū)突觸膜蛋白上的表達(dá)影響不同。
　　研究結(jié)果
　　1.癲癇患者認(rèn)知功能障礙及其影響因素
　　資料分析顯示智力平常40例(18.5%)、智力低常51例(23.4%)、智力邊界45例(20.6%)、智力缺損81例(37.5%),217例癲癇患者中存在認(rèn)知功能障礙者達(dá)177例(占

8、總?cè)藬?shù)81.5%)。同時(shí)發(fā)作頻率、發(fā)作時(shí)相,單藥-多藥療法均與認(rèn)知損害程度相關(guān)。臨床資料統(tǒng)計(jì)證實(shí)癲癇患者中存在認(rèn)知功能障礙的比例驚人,因此探索與研究對(duì)癲癇患者認(rèn)知功能具有保護(hù)作用的藥物治療手段是臨床上迫切需要解決的問題。2.褪黑素對(duì)慢性癲癇大鼠認(rèn)知功能的影響研究
　　2.1褪黑素干預(yù)組大鼠的自發(fā)性發(fā)作次數(shù)及持續(xù)時(shí)間、慢性期腦電圖每分鐘平均放電次數(shù)均較癲癇模型組及生理鹽水組有降低的影響趨勢,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(P>0.05)。

9、>　　2.2挑選各組發(fā)作次數(shù)相當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)動(dòng)物剔除自發(fā)性發(fā)作影響,褪黑素干預(yù)后對(duì)癲癇大鼠所致的工作記憶損傷具有一定保護(hù)作用,與模型組、生理鹽水組均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　2.3電生理實(shí)驗(yàn)表明褪黑素干預(yù)后LTP誘導(dǎo)的水平低于正常對(duì)照組,但顯著高于模型組。
　　3.褪黑素對(duì)慢性癲癇大鼠海馬區(qū)GluR2的表達(dá)影響研究
　　3.1造模后1w、2w、4w、6w與正常對(duì)照組比較GluR2在海馬總蛋白的表達(dá)量隨時(shí)間遞減,

10、但尤以4w最為明顯。
　　3.2正常對(duì)照組、造模后4w及褪黑素干預(yù)組比較結(jié)果顯示褪黑素干預(yù)組GluR2在海馬總蛋白表達(dá)量顯著高于模型組,并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;而與正常對(duì)照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　3.3正常對(duì)照組、造模后4w及褪黑素干預(yù)組比較結(jié)果顯示正常對(duì)照組GluR2在海馬CA1區(qū)總蛋白的表達(dá)量較另兩組高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。褪黑素干預(yù)組及模型組間并無顯著差異。
　　3.4正常對(duì)照組、造模后4w及褪黑素干預(yù)組比較結(jié)果顯示正常對(duì)照

11、組及褪黑素組海馬CA1區(qū)突觸膜上GluR2表達(dá)量均高于模型組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論
　　褪黑素對(duì)于慢性癲癇大鼠的自發(fā)性發(fā)作相關(guān)指標(biāo)、腦電每分鐘平均放電次數(shù)及放電波幅均有降低影響趨勢,但同模型組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著差異。剔除發(fā)作影響因素后,褪黑素可改善慢性癲癇大鼠的空間工作記憶,并且電生理相關(guān)實(shí)驗(yàn)顯示褪黑素干預(yù)組LTP誘發(fā)水平高于癲癇模型組。后進(jìn)一步通過westernblot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)褪黑素干預(yù)組GluR2在海馬總蛋白及CA1區(qū)