肺臟特絡(luò)細(xì)胞(telocytes)的研究.pdf

1、特絡(luò)細(xì)胞(telocytes)是近幾年新發(fā)現(xiàn)的一種間充質(zhì)來源的間質(zhì)細(xì)胞，由羅馬尼亞L.M.Popescu教授在2005年首次確認(rèn)，并于2010年正式命名。特絡(luò)細(xì)胞已被證實存在于哺乳動物體內(nèi)幾乎各種器官及組織中。特絡(luò)細(xì)胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)與其他間質(zhì)細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等有著顯著不同，其具有特征性的串珠樣細(xì)胞突起，可形成3D網(wǎng)絡(luò)支架結(jié)構(gòu)。
　　通過組織學(xué)和免疫學(xué)的方法已經(jīng)證實特絡(luò)細(xì)胞表面陽性表達(dá)CD34、c-kit、viment

2、in，與各種固有細(xì)胞如成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等互相接觸，參與細(xì)胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，尤其是與干細(xì)胞關(guān)系密切，可能發(fā)揮著“干細(xì)胞輔助細(xì)胞”的功能參與組織的損傷修復(fù)過程。但是限于在細(xì)胞分離、純化、培養(yǎng)等方面的諸多困難，對特絡(luò)細(xì)胞功能學(xué)的研究非常緩慢，目前大多數(shù)研究僅局限于組織學(xué)及形態(tài)學(xué)方面，僅有少數(shù)專注于細(xì)胞生物學(xué)功能方面的研究，而且還只是基于細(xì)致的組織學(xué)觀察而得出的推論和假設(shè)，尚缺乏體內(nèi)、體外的細(xì)胞實驗進(jìn)行論證。
　　我們認(rèn)為某種

3、細(xì)胞的結(jié)構(gòu)及其組織分布特征必然與其功能相適應(yīng)，因此在現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)上，本課題應(yīng)用組織學(xué)、細(xì)胞分子生物學(xué)、基因組學(xué)等方法，著重研究特絡(luò)細(xì)胞在肺臟的定位和分布特征，揭示肺臟特絡(luò)細(xì)胞與其他間質(zhì)細(xì)胞的差異，以及與干細(xì)胞的聯(lián)系，闡述其可能的細(xì)胞生物學(xué)功能，為進(jìn)一步應(yīng)用特絡(luò)細(xì)胞治療肺部疾病奠定理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。
　　第一部分肺臟特絡(luò)細(xì)胞的定位與分離培養(yǎng)
　　目的:
　　明確特絡(luò)細(xì)胞是否存在于肺臟中，揭示特絡(luò)細(xì)胞在氣管和肺組織中的

4、分布特征，研究特絡(luò)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征及體外培養(yǎng)的動態(tài)變化。
　　方法:
　　通過電子顯微鏡技術(shù)、免疫組織化學(xué)技術(shù)在肺組織中定位特絡(luò)細(xì)胞;體外分離小鼠/人肺特絡(luò)細(xì)胞，通過原代細(xì)胞培養(yǎng)、活細(xì)胞染色等觀察肺特絡(luò)細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu);通過Cell-IQ活細(xì)胞工作站動態(tài)觀察肺特絡(luò)細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中的形態(tài)學(xué)變化;采用流式細(xì)胞技術(shù)分析特絡(luò)細(xì)胞的表面生物標(biāo)記物。
　　結(jié)果:
　　掃描及透射電鏡在小鼠氣管軟骨、平滑肌之間的間隙中找到了特

5、絡(luò)細(xì)胞，其胞體帶有細(xì)長的突起telopode;透射電鏡發(fā)現(xiàn)特絡(luò)細(xì)胞位于肺間質(zhì)，緊鄰毛細(xì)血管及小支氣管，在肺干細(xì)胞周圍存在大量特絡(luò)細(xì)胞。Telopode呈管腔樣結(jié)構(gòu)，厚薄交替。免疫組化證實特絡(luò)細(xì)胞是CD34、c-kit、vimentin陽性細(xì)胞。從肺組織中分離、培養(yǎng)的細(xì)胞具有典型的特絡(luò)細(xì)胞特征。流式細(xì)胞檢測分析發(fā)現(xiàn)，人肺特絡(luò)細(xì)胞表面CD44，CD73，CD90，CD105為陽性，CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR表型結(jié)

6、果均為陰性，與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表型一致。體外細(xì)胞培養(yǎng)96小時的連續(xù)動態(tài)觀察提示特絡(luò)細(xì)胞具有游走性、趨化性，細(xì)胞間可形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可釋放顆粒物質(zhì)，也可以吞噬其他特絡(luò)細(xì)胞釋放的顆粒物質(zhì)。
　　結(jié)論:
　　氣管和肺組織中也廣泛存在特絡(luò)細(xì)胞，其分布具有特征性，參與小血管和小支氣管的支架結(jié)構(gòu)，與肺泡上皮細(xì)胞以及肺干細(xì)胞關(guān)系密切。人肺特絡(luò)細(xì)胞與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)相同的生物標(biāo)記物，特絡(luò)細(xì)胞具有干細(xì)胞的特性。特絡(luò)細(xì)胞之間可以形成網(wǎng)狀結(jié)

7、構(gòu)，可能參與細(xì)胞間的信號傳遞。
　　第二部分肺臟特絡(luò)細(xì)胞與纖維細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞的基因差異分析
　　目的:
　　探索特絡(luò)細(xì)胞與其他間質(zhì)細(xì)胞之間的基因差異，找出其特異性表達(dá)的基因，明確特絡(luò)細(xì)胞是否為一類新的間質(zhì)細(xì)胞。
　　方法:
　　分離、培養(yǎng)小鼠肺特絡(luò)細(xì)胞，與小鼠肺成纖維細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞一起分別做全基因表達(dá)譜分析，對比三種細(xì)胞之間的基因表達(dá)，尋找其中的差異基因和共表達(dá)基因。
　　結(jié)果:
　

8、　與小鼠成纖維細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相比較，小鼠特絡(luò)細(xì)胞有2000個基因高表達(dá)，有超過4000個基因低表達(dá)。在這數(shù)千個基因中，三種細(xì)胞共同表達(dá)的基因有156個，進(jìn)一步通過String Network分析發(fā)現(xiàn)其中又有46個基因之間有不同程度的關(guān)聯(lián)性，而小鼠特絡(luò)細(xì)胞特異性表達(dá)Rbp1基因。差異基因主要體現(xiàn)在細(xì)胞的發(fā)生、生長過程，解剖與形態(tài)結(jié)構(gòu)等方面。
　　結(jié)論:
　　特絡(luò)細(xì)胞的基因表達(dá)與成纖維細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞差異巨大，尤其

9、是特異性表達(dá)Rbp1基因。特絡(luò)細(xì)胞是一類新的間質(zhì)細(xì)胞
　　第三部分肺臟特絡(luò)細(xì)胞對血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷修復(fù)作用
　　目的:
　　探索特絡(luò)細(xì)胞是否能夠合成分泌與血管生成相關(guān)的細(xì)胞因子，研究特絡(luò)細(xì)胞是否能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷修復(fù)。
　　方法:
　　分離、培養(yǎng)小鼠/人肺特絡(luò)細(xì)胞，分別培養(yǎng)24、48小時，用ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子VEGF，EGF，TNF-α，IFN-γ，GM-

10、CSF，MCP-1，TIMP-1，TIMP-2水平;分別以DMEM完全培養(yǎng)基和特絡(luò)細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，檢測細(xì)胞增殖能力;以脂多糖刺激人肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞，分別以DMEM完全培養(yǎng)基和特絡(luò)細(xì)胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)，用Matrigel膠法檢測微血管內(nèi)皮細(xì)胞的小管生成能力。
　　結(jié)果:
　　小鼠/人肺特絡(luò)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中與血管生成相關(guān)的細(xì)胞因子水平升高，尤其是VEGF、EGF。與對照組相比，人肺特絡(luò)細(xì)胞條件培養(yǎng)基提高了人肺