豚鼠肺臟上皮細胞形態(tài)組成學及TLR信號因子的表達定位研究.pdf

1、豚鼠由于在發(fā)育、生理和免疫反應機制等方面與人類存在諸多的相似而成為一種用于研究發(fā)育生物學和疾病的發(fā)病機制與致病機理的理想動物模型。豚鼠對多種呼吸道病原體高度敏感，如豚鼠很容易感染結核分枝桿菌，且感染后產生酷似人類的進行性肺結核病變，這使得豚鼠成為結核分枝桿菌分離、鑒別、診斷和各種抗結核病藥物和疫苗的篩選，以及致病機理研究的理想動物模型之一。然而，相對其它實驗動物而言，由于缺乏有效的免疫學試劑及豚鼠肺臟細胞生物學的相關參考資料，極大限制了

2、利用豚鼠動物模型開展肺臟疾病的研究工作。因此，系統(tǒng)研究豚鼠呼吸道上皮細胞形態(tài)組成學及主要先天免疫調控信號通路，TLR信號在豚鼠肺臟中的表達定位，將有助于進一步揭示豚鼠肺臟上皮的生物學特征，為研究豚鼠的肺臟先天免疫機制及其作為呼吸道疾病模型的致病機理提供理論基礎。為此，我們開展了相關的研究工作，并取得以下結果：
　　 1.本項目通過電鏡、組織化學染色(HE、PAS等)、免疫組織化學(IHC)染色等方法對豚鼠呼吸道主要上皮細胞的類型

3、組成(基底細胞、纖毛細胞、杯狀細胞、克拉拉細胞、神經內分泌細胞)進行形態(tài)學和微細結構等細胞生物學特征的觀察。結果顯示，豚鼠肺臟上皮細胞的組成類型與特征比小鼠和人的肺臟存在更多的相似性，這表明其比小鼠更適合于人肺臟疾病動物模型。另外，研究發(fā)現抗人、小鼠和/或兔源的Keratin14、Keratin18、CGRP、CCSP和Mucin5AC抗體均與豚鼠發(fā)生交叉反應，為進一步利用這些免疫學試劑探討豚鼠肺臟上皮細胞在先天免疫中的作用機理奠定了基

4、礎。
　　 2.提取新鮮豚鼠肺組織的RNA，反轉錄為cDNA作為模板，通過反轉錄PCR的方法擴增、克隆并鑒定了豚鼠肺臟組織中TLRs信號通路中的相關信號分子TLR1、TLR2、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8、TLR10、MYD88和TRAF6等9種TLR信號通路因子的基因片段，并利用RT-PCR的方法檢測到它們在肺臟中均有表達；免疫組化結果顯示TLR4/2、TLR3、TLR6、TLR11、MYD88和TRAF6為染色陽性

5、，表明這6種作用于其它品種的抗體可用于豚鼠相關信號蛋白表達的免疫組化鑒定。Realtime-qPCR的檢測結果發(fā)現，在普通級實驗動物不同個體間的TLR2、TLR4、TLR7和TLR10存在表達水平的差異，且下游信號分子MYD88和TRAF6總體表達水平較高。根據免疫組化和Realtime-qPCR試驗結果，對相對表達量較高的MYD88和TLR11與肺臟上皮細胞的特異表達蛋白進行免疫熒光雙染，準確定位了它們在豚鼠肺臟上皮細胞中的克拉拉細胞