Maresin1促進(jìn)小鼠急性肺損傷炎癥消退及其機(jī)制的研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分展開論述：
　　第一部分 Maresin1抑制脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷模型中性粒細(xì)胞的粘附
　　目的：探討Maresin1(MaR1)對脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷(acute lung injury，ALI)模型炎癥反應(yīng)的影響及其機(jī)制。
　　方法：128只雄性SPF級BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組：（1）假手術(shù)組（sham）：小鼠經(jīng)口氣管插管滴入生理鹽水，

2、1小時后尾靜脈注射生理鹽水。（2）脂多糖組(LPS)：小鼠經(jīng)口氣管插管滴入LPS（3mg/kg），1小時后尾靜脈注射生理鹽水。（3）MaR1小劑量組（LPS+LD-MaR1）：小鼠經(jīng)口氣管插管滴入LPS（3mg/kg），1小時后尾靜脈注射MaR1（0.1ng/只）。（4）MaR1大劑量組(LPS+HD-MaR1)：小鼠經(jīng)口氣管插管滴入LPS（3mg/kg），1小時后尾靜脈注射MaR1（1ng/只）。四組小鼠在氣管給藥后24小時處死。抽取

3、動脈血監(jiān)測血?dú)?。觀察小鼠肺組織病理學(xué)改變，肺泡灌洗液(broncheoalveolar lavage fluid, BALF)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)目的變化，以及肺組織濕干重比。分光光度計法檢測BALF總蛋白含量與肺組織髓過氧化物酶活性。ELISA法檢測BALF炎癥細(xì)胞因子TNF-α，IL-1β，IL-6，KC，IL-10，MCP-5，MIP-1α和MIP-1γ。免疫組化法觀察肺組織中性粒細(xì)胞浸潤。流式細(xì)胞學(xué)檢測中性粒細(xì)胞與血小板之間的

4、粘附。Western blotting檢測肺組織ICAM-1，P-選擇素和CD24的表達(dá)。
　　結(jié)果：大劑量MaR1能顯著減輕LPS誘導(dǎo)的肺損傷和肺水腫，抑制中性粒細(xì)胞浸潤，改善氧合功能。同時大劑量MaR1能下調(diào)促炎癥細(xì)胞因子（TNF-α，IL-1β，IL-6，KC）和趨化因子（KC，MCP-5，MIP-1α，MIP-1γ）的表達(dá)，上調(diào)抗炎癥細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)。流式細(xì)胞學(xué)結(jié)果證實MaR1能抑制中性粒細(xì)胞和血小板之間的相互作用

5、。肺組織Western blotting證實MaR1能減少ICAM-1，P-選擇素和CD24的表達(dá)。
　　結(jié)論：大劑量的MaR1能顯著改善LPS誘導(dǎo)的肺組織結(jié)構(gòu)的破壞和氧合功能障礙，下調(diào)中性粒細(xì)胞的粘附作用，降低促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，從而減輕LPS誘導(dǎo)的ALI的炎癥反應(yīng)。
　　第二部分 Maresin1促進(jìn)中性粒細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究
　　目的：研究MaR1對人中性粒細(xì)胞凋亡的影響并探討其可能機(jī)制。
　　方法：通過

6、Percoll非連續(xù)密度梯度離心法，分離人中性粒細(xì)胞進(jìn)行體外離體培養(yǎng)。用含MaR1(1-100nM)或/和caspase廣譜抑制劑（z-VAD-fmk）處理30min后，加入LPS（100-500ng/ml）處理。給予LPS后24小時，流式細(xì)胞學(xué)檢測中性粒細(xì)胞凋亡和中性粒細(xì)胞caspase-3的活性。Western blotting檢測中性粒細(xì)胞p-ERK1/2，p-p38，p-AKT，Bcl-2和Mcl-1的表達(dá)。
　　結(jié)果：M

7、aR1（1-10nM）不影響中性粒細(xì)胞凋亡，而高濃度100nM MaR1能顯著抑制中性粒細(xì)胞凋亡。LPS可呈劑量依賴性地抑制中性粒細(xì)胞凋亡，500ng/ml LPS抑制中性粒細(xì)胞凋亡最強(qiáng)。盡管MaR11nM也能拮抗LPS抑制中性粒細(xì)胞凋亡的作用，但在MaR110nM時拮抗作用最強(qiáng)。同時，z-VAD-fmk可明顯抑制MaR1促進(jìn)中性粒細(xì)胞凋亡和上調(diào)caspase-3表達(dá)的作用。Western blotting結(jié)果顯示，LPS可誘導(dǎo)中性粒細(xì)

8、胞的ERK1/2，p38，AKT磷酸化，作用30min時最為顯著；10nM MaR1處理30min后，可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的ERK1/2，p38，AKT的磷酸化。此外，10nM MaR1處理2小時后，可明顯抑制LPS上調(diào)的Bcl-2和Mcl-1的表達(dá)。
　　結(jié)論：MaR1能拮抗LPS抑制中性粒細(xì)胞凋亡的作用，其作用機(jī)制可能是通過阻斷LPS誘導(dǎo)ERK1/2，p38，AKT磷酸化，和 Bcl-2和Mcl-1的表達(dá)，最終激活中性粒細(xì)胞c

9、aspase-3活性來實現(xiàn)。
　　第三部分 Maresin1通過促進(jìn)中性粒細(xì)胞凋亡加速急性肺損傷炎癥消退
　　目的：探討MaR1對LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI炎癥消退的影響及其機(jī)制的研究。
　　方法：實驗分為兩部分。第一部分探討MaR1是否能促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的小鼠ALI炎癥消退。80只雄性SPF級BALB/c小鼠隨機(jī)分為兩組：LPS組和LPS+MaR1組。經(jīng)口氣管內(nèi)滴注LPS（3mg/kg）制備小鼠ALI模型。24小時后尾靜脈

10、注射MaR1（1ng/只）或生理鹽水。分別于不同的天數(shù)處死小鼠：0、1、2、4、7天（每次處死8只）。觀察小鼠肺組織病理學(xué)改變，BALF中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)目的變化，以及肺組織濕干重比。分光光度計法檢測BALF總蛋白的含量。第二部分探討MaR1能否通過促進(jìn)中性粒細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮促進(jìn)ALI炎癥消退。128只雄性SPF級BALB/c小鼠隨機(jī)分為四組：假手術(shù)組，LPS組，LPS+MaR1治療組, LPS+MaR1+caspase廣譜抑制劑

11、組。除假手術(shù)組，每只小鼠氣管內(nèi)滴注LPS(3mg/kg)，24小時后尾靜脈注射MaR1（1ng/只）或生理鹽水。同時腹腔注射caspase廣譜抑制劑z-VAD-fmk（10μg/kg），分別于4小時后和8小時后再腹腔追加z-VAD-fmk，其余組給予等體積的生理鹽水。給予MaR124小時后，流式細(xì)胞學(xué)檢測中性粒細(xì)胞凋亡和中性粒細(xì)胞caspase-3的活性。觀察小鼠肺組織病理學(xué)改變，BALF中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞細(xì)胞數(shù)目的變化，以及巨噬細(xì)胞

12、吞噬凋亡小體；分光光度計法檢測BALF總蛋白含量和肺組織髓過氧化物酶活性；ELISA法檢測BALF炎癥因子TNF-α，IL-1β，IL-10，MCP-5，MIP-1γ。
　　結(jié)果：第一部分結(jié)果顯示氣管內(nèi)滴注LPS后，肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，中性粒細(xì)胞浸潤以及肺水腫在24小時達(dá)炎癥高峰。24小時后肺損傷逐漸減輕，至第7天肺損傷基本恢復(fù)正常。在炎癥高峰期（24小時），尾靜脈注射MaR1明顯減輕了LPS誘導(dǎo)的肺損傷。肺損傷在第4天基本恢復(fù)正常。

13、第二部分結(jié)果顯示MaR1能促進(jìn)BALF中性粒細(xì)胞凋亡并上調(diào)中性粒細(xì)胞caspase-3的表達(dá)。同時MaR1能減輕肺組織病理學(xué)損傷，減少中性粒細(xì)胞浸潤，降低肺組織髓過氧化物酶的活性和抑制BALF炎癥因子TNF-α，IL-1β，MCP-5，MIP-1γ的產(chǎn)生，促進(jìn)抗炎癥細(xì)胞因子IL-10的產(chǎn)生。相反，z-VAD-fmk可部分拮抗MaR1的促凋亡作用，同時顯著抑制MaR1對急性肺損傷的保護(hù)作用。
　　結(jié)論：MaR1通過促進(jìn)中性粒細(xì)胞凋亡