母體期慢性鋁暴露對(duì)子代大鼠海馬LTP、PKC活性和Ng含量的影響.pdf

1、鋁大量蓄積體內(nèi)可產(chǎn)生毒性作用。國(guó)內(nèi)外許多流行病學(xué)調(diào)查和研究表明，鋁易致神經(jīng)元損傷，引起智力和認(rèn)知能力下降等學(xué)習(xí)和記憶方面的缺欠，且這是一個(gè)長(zhǎng)期的慢性的神經(jīng)病理過程，涉及到腦發(fā)育的各個(gè)階段。 海馬是學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵腦區(qū)，海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation，LTP)是NMDA (N-甲基-D-門冬氨酸)受體依賴性突觸傳遞效能的持續(xù)性增強(qiáng)，是公認(rèn)的腦學(xué)習(xí)記憶功能在突觸水平的研究模型和神經(jīng)基礎(chǔ)。因此，研究鋁暴露對(duì)

2、LTP及與其突觸機(jī)制有關(guān)的各項(xiàng)生化指標(biāo)的影響，有助于從突觸和蛋白分子水平闡明鋁損害腦學(xué)習(xí)記憶功能的作用機(jī)制。目前雖然鋁對(duì)LTP損害作用的觀察很多，但鋁對(duì)LTP損害作用的突觸機(jī)制尚未完全闡明。已明確，蛋白激酶C(proteinkinase C，PKC)是LTP產(chǎn)生的必需酶，而神經(jīng)顆粒素(Neurogranin，Ng)是一種突觸后腦特異性蛋白質(zhì)，是PKC的天然作用底物，與LTP的誘導(dǎo)與維持關(guān)系密切。同時(shí)，母體期是子代腦發(fā)育的一個(gè)重要時(shí)期，母

3、體期鋁暴露會(huì)不會(huì)感染子代，是一個(gè)關(guān)系到子代健康的大問題。因此，本實(shí)驗(yàn)擬采用母體慢性鋁暴露大鼠模型，觀察母體期鋁暴露對(duì)子代大鼠海馬LTP誘導(dǎo)和維持、PKC活性及Ng含量的影響，以期從PKC及Ng角度為闡明此發(fā)育階段鋁影響LTP的機(jī)制提供一個(gè)新視點(diǎn)。 材料與方法 一、實(shí)驗(yàn)材料 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 wistar大鼠，♀：♂為3:1(體重150-200g)及其所繁殖的子代鼠。 2、主要試劑 三氯化鋁(分

4、析純)；抗大鼠Ng單克隆抗體；堿性磷酸酶標(biāo)記的兔抗山羊二次抗體；PepTag非放射性PKC活性測(cè)定試劑盒。 3、主要儀器 大鼠跳臺(tái)反應(yīng)箱；通用電泳儀；凝膠電泳成像系統(tǒng)；低溫冷凍離心機(jī)；Spectronic21型的紫外-可見分光光度計(jì)；電生理相關(guān)儀器；瓊脂糖凝膠電泳儀。 二、實(shí)驗(yàn)方法 1、分組及動(dòng)物模型建立雌性Wistar大鼠45只隨機(jī)分為3組，從其與雄性大鼠合籠始至子代斷乳止，在飼料相同條件下，分別飲用蒸

5、餾水、0.2％及0.4％氯化鋁(A1C13)溶液。 2、行為學(xué)測(cè)定采用跳臺(tái)法檢測(cè)鋁對(duì)學(xué)習(xí)記憶行為的影響，記錄大鼠第1次跳下平臺(tái)的時(shí)間(潛伏期)和5 min內(nèi)受到電擊(即跳下)次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))。 3、電生理LTP測(cè)定20％烏拉坦(urethane，6.5ml/kg，ip)麻醉后，將動(dòng)物頭部固定于腦立體定位儀上，在Schaffer側(cè)枝部位(坐標(biāo)：前囟后3.3mm；旁開3.8mm；皮層下3.8mm)插入刺激電極。 4、

6、海馬PKC活性的測(cè)定采用瓊脂糖凝膠電泳方法測(cè)定海馬PKC的活性。參照PepTag非放射性PKC活性測(cè)定試劑盒說明書。 5、Ng含量的測(cè)定采用Western blot方法測(cè)定海馬Ng的含量。 6、腦組織及血液中鋁含量測(cè)定采用原子吸收石墨爐法測(cè)定腦鋁和血鋁含量。 7、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0(statistical package for the social science，SPSS)統(tǒng)計(jì)分析處理軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)

7、行處理，P<0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)資料用X±S表示。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 一、記憶行為學(xué)指標(biāo)與對(duì)照組大鼠第1次跳下平臺(tái)的潛伏期(300±0.00秒)相比，0.2％-Al(202.71±81.99秒)和0.4％-Al組(19.67±8.44秒)差異均非常顯著，P<0.01。兩暴露組5min內(nèi)錯(cuò)誤次數(shù)(1.43±0.85次，2.47±0.99次)與對(duì)照組(0.00±0.00次)相比也均存在顯著差異，P<0.05。兩暴露

8、組之間差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義， P<0.01。 二、電生理LTP測(cè)試結(jié)果HS后，與對(duì)照組PS幅值增強(qiáng)率(143.94±29.93％)相比，0.2％-Al(115.29±14.80％)和0.4％(103.62±13.70％)，差異均非常顯著，P<0.01。但兩暴露組之間差異不顯著，P>0.05。 三、海馬PKC活性測(cè)定結(jié)果(PKC活性單位為pmol/min·mg)與對(duì)照組海馬組織PKC的全細(xì)胞(827.60±42.52)、胞

9、膜(340.99±24.50)、胞漿活性(481.32±22.52)及胞膜與胞漿PKC活性比值(0.7114±0.0686)相比，0.2％-Al組(506.41±20．56、155.69±12.63、55.79±25.98、0.4411±0.0623)和0.4％-Al組(494.65±6.81、140.11±4.44、353.44±8.28、0.3966±0.0163)均降低，差異顯著，P<0.01。但兩暴露組的各項(xiàng)指標(biāo)差異不顯著，P>

10、0.05。 四、海馬Ng含量測(cè)定結(jié)果與對(duì)照組海馬Ng表達(dá)的灰度值(62.56±8.74)相比，0.2％-Al組(52.33±4.01)和0.4％-Al組(50.75+5.99)差異顯著，P<0.01。但兩暴露組之間差異不顯著，P>0.05。 五、腦組織與血中的鋁含量測(cè)定結(jié)果與對(duì)照組腦鋁含量(6.21±2.37μg/g)、血鋁含量(33.9μ38.74μg/L)相比，0.2％-Al組(15.68±4．48μg/g、47.4

11、3±14.38μg/L)和0.4％-Al組(18.79±5.18μg/g、55.56±19．07μg/L)差異均顯著，P<0.01。但兩暴露組之間差異不顯著，P>0.05。 討論 母體期是子代腦發(fā)育重要階段，此期的母體鋁暴露對(duì)子代腦的智力發(fā)育是否有影響，是一個(gè)值得關(guān)注的方面。因此，研究鋁及其化合物在母體期的潛在發(fā)育毒性，對(duì)鋁導(dǎo)致的兒童智力和認(rèn)知能力低下性神經(jīng)疾病的早期治療與預(yù)防具有重要意義。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，母體慢性鋁暴露

12、可損害子代海馬LTP的誘導(dǎo)與維持，其損害的程度有隨暴露劑量增加而加重的趨勢(shì)，行為學(xué)測(cè)試的結(jié)果也從側(cè)面反映了這種關(guān)系。腦鋁與血鋁的變化趨勢(shì)也基本與之一致。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，母體鋁暴露的子代大鼠的海馬PKC全細(xì)胞活性、胞膜、胞漿活性及胞膜與胞漿活性比值，與對(duì)照組相比，都分別呈顯著性降低，我們分析認(rèn)為，鋁通過抑制PKC活性而使LTP產(chǎn)生的必需物質(zhì)-B-50及NMDA受體的磷酸化調(diào)節(jié)發(fā)生障礙，從而損害大鼠LTP及導(dǎo)致其學(xué)習(xí)記憶能力下降。

13、 本實(shí)驗(yàn)對(duì)子代大鼠進(jìn)行海馬Ng的含量測(cè)定結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，母體鋁暴露的子代大鼠海馬Ng含量下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。推測(cè)Ng含量下降的原因之一可能是樹突棘數(shù)量的減少和細(xì)胞缺失，因?yàn)橛醒芯勘砻?，鋁負(fù)荷過量大鼠海馬CA<,1>區(qū)神經(jīng)元核固縮和神經(jīng)元減少現(xiàn)象明顯。 總之，對(duì)母體實(shí)施鋁暴露會(huì)影響到子代，且鋁對(duì)在LTP機(jī)制中起重要作用的PKC和Ng的影響是多方面的，需要進(jìn)一步的探討。 結(jié)論： 1、母體期慢性鋁暴露可