柔嫩艾美耳球蟲早熟株選育及生物學(xué)特性研究.pdf

1、雞球蟲病是一種重要的寄生蟲性原蟲病，對養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)估計(jì)，全世界每年因球蟲病造成的經(jīng)濟(jì)損失達(dá)20億美元。該病的主要特征是減輕體重和降低飼料轉(zhuǎn)化率。目前，球蟲病的控制主要依靠藥物，但由于耐藥蟲株的普遍存在以及人們對藥殘問題的日趨關(guān)注等原因，使抗球蟲藥的發(fā)展受到極大的限制。因此，人們把研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向雞球蟲病的免疫預(yù)防。 1975年Jeffer建立了E.tenella早熟株選育方法：通過親代蟲株多次選擇最早成熟的卵囊反復(fù)傳

2、代后，使其內(nèi)生發(fā)育周期縮短，成為一株潛在期明顯縮短、繁殖力和致病性顯著降低，但保持良好免疫原性的E.tenella早熟株。經(jīng)研究表明，早熟株的弱毒性和早熟性具有遺傳穩(wěn)定性，放松選擇壓力反復(fù)傳代后也沒有恢復(fù)現(xiàn)象。隨后，各國科學(xué)家對艾美耳屬7個種球蟲都進(jìn)行早熟選育：E.acervulina(McDonaldetal.，1982)，E.mitis(McDonaldandShirley，1984)，E.praecox(Shirleyetal.，

3、1984)，E.necatrix(ShirleyandBellatti，1984)，E.maxima(McDonaldetal.，1986andShirleyandBellati，1988)，E.brunetti(Shirleyetal.，1986)，E.tenella(McDonaldetal.，1986)，并研究其生物學(xué)特性，在深入了解雞球蟲病的保護(hù)性免疫機(jī)制基礎(chǔ)之上研制了抗雞球蟲病的早熟株弱毒活苗，在免疫預(yù)防球蟲病中發(fā)揮了極其重要

4、的作用。目前，已有2種球蟲早熟株疫苗注冊上市即英國的Paracox(R)和捷克的Livacox(R)，通過早熟選育方法獲得的弱毒苗是球蟲疫苗的研究方向。 本文以E.tenella孢子化卵囊為蟲種，采用早熟株選育方法對E.tenella進(jìn)行連續(xù)26代早熟選育，其潛在期由141h縮短至118h，縮短了23h。對早熟株與母株孢子化卵囊大小、繁殖能力、致病性和免疫原性等基本生物學(xué)特性進(jìn)行比較，結(jié)果表明：早熟株孢子化卵囊比母株的小且差異顯

5、著(P＜0.05)。用4個不同劑量球蟲卵囊分別感染雞時發(fā)現(xiàn)，早熟株繁殖能力與母株相當(dāng)，每個卵囊的繁殖能力隨著劑量的增大而減??；早熟株的排卵囊高峰較母株前移，但峰值較母株低。用臨床癥狀、平均增重、死亡率、病變記分等指標(biāo)對致病性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示：4個劑量組早熟株平均增重與對照組相比差異不顯著(P＞0.05)，而母株組與對照組相比平均增重顯著下降(P＜0.05或P＜0.01)；4個劑量組的早熟株組死亡率均為0，而母株組分別為0、25％、25

6、％、31.3％；感染劑量越大，早熟株與母株間病變記分差異越顯著，由此認(rèn)為，早熟株的致病性低于母株。在同等劑量免疫之下，平均增重、死亡率、盲腸病變記分及飼料轉(zhuǎn)化率等方面的分析表明，早熟株的免疫原性與母株相當(dāng)。另外，各免疫組對球蟲卵囊的再攻擊產(chǎn)生明顯的抑制作用，各免疫組對同種同株球蟲攻擊時的卵囊抑制率高于同種不同株球蟲卵囊的攻擊；兩次免疫后，早熟株和母株免疫組對攻蟲后的卵囊排量都有強(qiáng)烈的抑制作用，卵囊抑制率均在95％以上。 本實(shí)驗(yàn)通

7、過放松選擇傳代對所選育的E.tenella早熟株連續(xù)傳三代來對其遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行研究，結(jié)果表明，E.tenella早熟株在潛在期及排卵囊規(guī)律方面都較穩(wěn)定。 為了在基因水平上對E.tenella早熟株進(jìn)行更深入研究，本文以E.tenella早熟株與母株的18SrRNA基因作為研究目標(biāo)，根據(jù)Barta提供的真核生物18SrRNAPCR擴(kuò)增通用引物從E.tenella早熟株和母株孢子化卵囊總DNA中擴(kuò)增出18SrRNA基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠

8、電泳檢測，將大小與18SrRNA基因預(yù)計(jì)分子量一致的片段純化后連接到p.GEM-T-easy克隆載體中，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，得到的轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR鑒定篩選陽性克隆后進(jìn)行測序及序列分析，登錄GeneBank。結(jié)果表明，E.tenella早熟株與母株的18SrRNA基因序列全長分別為1796bp和1799bp，二者同源性為99％，早熟株18SrRNA基因共有17個堿基發(fā)生突變，二者的二級結(jié)構(gòu)也發(fā)生很大的差異，早熟株與母株基因登錄