ROR2在骨肉瘤組織及細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)行為影響的初步研究.pdf

1、骨肉瘤(Oseteosarcoma)是除漿細(xì)胞瘤外最常見(jiàn)的惡性骨原發(fā)性腫瘤，其組織學(xué)特點(diǎn)是在多數(shù)情況下腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生骨樣或不成熟骨。骨肉瘤發(fā)病率各國(guó)統(tǒng)計(jì)數(shù)字差異較大，約1/10萬(wàn)-0.1/10萬(wàn)。骨肉瘤易于侵及生長(zhǎng)迅速的干骺端，其典型的位置是在長(zhǎng)管狀骨，股骨遠(yuǎn)端及脛骨、肱骨的近端是最常見(jiàn)的發(fā)病部位，全部病人的50％-70％病變發(fā)生在膝關(guān)節(jié)周圍。雖然骨肉瘤在各年齡組均有報(bào)道而且其發(fā)病率低于其他常見(jiàn)惡性腫瘤，但由于該病好發(fā)于青少年長(zhǎng)骨時(shí)期，有

2、研究證實(shí)75％的骨肉瘤子10歲-30歲人群發(fā)病。起病時(shí)無(wú)明顯的臨床癥狀，極易與外傷混淆，且惡性程度高早期即可能發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，故其危害性大死亡率很高。臨床骨科工作者一直致力于對(duì)其防治的研究，希望尋找到骨肉瘤精確有效治療的靶點(diǎn)。
　　 ROR2(Receptor Tyrosine Kinase-like Orphan Receptor)全稱為受體酪氨酸激酶樣孤核受體2，其屬于受體酪氨酸激酶家族(RTKs)，此激酶家族成員在動(dòng)物發(fā)育的形

3、態(tài)發(fā)生及組織分化過(guò)程中具有重要意義。它們參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、粘附、遷移以及凋亡等多種細(xì)胞功能。ROR受體屬于受體酪氨酸激酶家族中的孤核受體一類，在進(jìn)化上非常保守。在哺乳動(dòng)物其包含兩種結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白R(shí)OR1和ROR2。已有的研究證實(shí)ROR2在面部、四肢、心臟、大腦及肺等重要器官和組織中均有表達(dá)，對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼的發(fā)育具有重要作用。其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)可調(diào)節(jié)軸突的生長(zhǎng)。在人類，ROR2基因的純合子型突變可導(dǎo)致Robinow綜合癥，此種病

4、癥表現(xiàn)出多種骨骼發(fā)育不良：身材矮小、全身肢體短小、脊柱部分節(jié)段缺失及面部骨骼畸形。ROR2基因的雜合子型突變與以手指及足趾遠(yuǎn)節(jié)缺失為特征的brachydactyly type B綜合癥有關(guān)。在小鼠，ROR2基因的缺乏可導(dǎo)致侏儒癥、肢體及尾巴短小、面部畸形、心室間隔缺損以及引起新生兒死亡的呼吸功能障礙。已有的研究顯示ROR2可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，Real-time RT-PCR檢測(cè)顯示ROR2在人類骨髓間質(zhì)干細(xì)胞中無(wú)表達(dá)，隨其的成骨

5、分化逐漸增高，而當(dāng)其分化為定型的前成骨細(xì)胞時(shí)ROR2的表達(dá)達(dá)到峰值，而后又迅速下降并在正常骨細(xì)胞中表達(dá)消失。ROR2受體通過(guò)二聚化而激活可促進(jìn)人類間質(zhì)干細(xì)胞的成骨轉(zhuǎn)化并在組織培養(yǎng)期間增加新的骨形成。ROR2在小鼠體內(nèi)試驗(yàn)時(shí)也表現(xiàn)出很強(qiáng)的促進(jìn)骨形成的能力。以上結(jié)果均提示ROR2在骨骼的發(fā)育過(guò)程中具有重要作用。而且研究證實(shí)ROR2對(duì)于骨骼發(fā)育的影響主要是通過(guò)與WNT家族蛋白結(jié)合，調(diào)節(jié)經(jīng)典或非經(jīng)典WNT信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。
　　 有研究顯

6、示ROR2與某些腫瘤的發(fā)生存在一定的關(guān)系。例如其在黑色素瘤組織中有較強(qiáng)的表達(dá)，還有研究證實(shí)ROR2是Hela宮頸癌細(xì)胞的促存活激酶。最新的研究顯示在口腔鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)ROR2的增強(qiáng)表達(dá)而且ROR2的高表達(dá)與其惡性程度相關(guān)以及ROR2可促進(jìn)腎細(xì)胞惡性腫瘤的生長(zhǎng)。ROR2與腫瘤之間的關(guān)系均與其可與Wnt蛋白結(jié)合，激活或調(diào)整某一WNT信號(hào)通路有關(guān)。而最近的研究顯示W(wǎng)NT通路在放射誘導(dǎo)的的骨肉瘤中具有轉(zhuǎn)錄活性。同時(shí)WNT/β連環(huán)蛋白通路的拮抗

7、劑姜黃素和PKF118-310在人類骨肉瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中顯示了抗腫瘤活性。而且2008年有學(xué)者研究證實(shí)特異性酪氨酸激酶抑制劑(包括表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體抑制劑及met抑制劑等)可在體外抑制骨肉瘤細(xì)胞的活動(dòng)能力、集落形成和侵襲能力。此結(jié)果顯示酪氨酸激酶可能調(diào)節(jié)骨肉瘤的形成及轉(zhuǎn)移，其可能成為骨肉瘤治療的新靶點(diǎn)。
　　 ROR2作為酪氨酸激酶家族成員的身份、其在部分腫瘤中的表達(dá)及其生物學(xué)行為、骨肉瘤的成骨特性和R

8、OR2對(duì)于骨骼發(fā)育的影響及其通過(guò)WNT信號(hào)通路調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞增殖及分化的生物學(xué)特點(diǎn)使得我們懷疑ROR2可能在骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中具有一定的作用，其可能促進(jìn)了骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展及惡性生物學(xué)行為。因此，ROR2可能成為骨肉瘤新的治療靶點(diǎn)。針對(duì)ROR2和骨肉瘤關(guān)系的研究將為骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制研究和治療靶點(diǎn)選擇提供一條全新的思路。
　　 第一部分：ROR2在骨肉瘤組織及細(xì)胞中的表達(dá)及意義。
　　 目的：研究ROR2在骨肉瘤組織及細(xì)胞

9、中的表達(dá)情況，探討其表達(dá)的臨床意義。
　　 方法：使用Western-bloting實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)4例骨肉瘤和3例骨軟骨瘤患者新鮮原發(fā)灶標(biāo)本中ROR2表達(dá)情況；使用免疫組化方法檢測(cè)55例骨肉瘤患者和15例骨軟骨瘤患者原發(fā)灶標(biāo)本中ROR2表達(dá)情況并結(jié)合患者臨床資料了解其臨床意義；使用RT-PCR實(shí)驗(yàn)方法檢驗(yàn)SaoS-2骨肉瘤細(xì)胞中ROR2mRNA表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：①通過(guò)免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)55例骨肉瘤患者標(biāo)本中有39

10、例患者標(biāo)本有ROR2陽(yáng)性表達(dá)，其陽(yáng)性表達(dá)率為70.91％，檢測(cè)的15例骨軟骨瘤患者標(biāo)本有3例ROR2陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為20.00％，兩者陽(yáng)性表達(dá)率有顯著性差異(X2=12.73 P<0.05)。②通過(guò)Western-bloting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)新鮮骨軟骨瘤和新鮮骨肉瘤組織中ROR2蛋白表達(dá)的結(jié)果顯示兩者標(biāo)本中ROR2蛋白表達(dá)有顯著性差異(P<0.05)。③通過(guò)RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了SaoS-2骨肉瘤細(xì)胞株中ROR2基因表達(dá)情況，結(jié)果顯示其

11、內(nèi)有ROR2基因表達(dá)。④檢測(cè)了有或無(wú)轉(zhuǎn)移的骨肉瘤患者腫瘤標(biāo)本中ROR2表達(dá)的結(jié)果顯示在有轉(zhuǎn)移的患者標(biāo)本中ROR2的陽(yáng)性表達(dá)率為100.00％，而在無(wú)腫瘤轉(zhuǎn)移患者標(biāo)本中ROR2陽(yáng)性表達(dá)率為61.91％，兩者表達(dá)陽(yáng)性率有顯著性差異(x2=5.26P<0.05)。⑤檢測(cè)Ennecking分期分別為Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期的骨肉瘤患者腫瘤標(biāo)本中ROR2表達(dá)的結(jié)果顯示ROR2在骨肉瘤Enneking分期Ⅰ期表達(dá)陽(yáng)性率為22.22％(2/9)，Ⅱ期表達(dá)陽(yáng)性

12、率為72.73％(24/33)，Ⅲ期表達(dá)陽(yáng)性率為100.00％(13/13)。Ⅰ期與Ⅱ期間有顯著性差異(X2=5.66 P<0.05)，Ⅰ期與Ⅲ期間有顯著性差異(X2=11.46P<0.05)，而Ⅱ期與Ⅲ期間無(wú)顯著性差異(X2=2.85 P>0.05)。
　　 結(jié)論：①ROR2基因和蛋白在骨肉瘤細(xì)胞及組織中有較強(qiáng)表達(dá)，而且其可能影響骨肉瘤的生物學(xué)行為。
　　 第二部分：小干擾RNA對(duì)骨肉瘤細(xì)胞株ROR2基因及蛋白表達(dá)水平

13、的影響。
　　 目的：研究小干擾RNA對(duì)骨肉瘤細(xì)胞株ROR2基因及蛋白表達(dá)水平的影響。
　　 方法：使用化學(xué)合成法構(gòu)建針對(duì)ROR2的小干擾RNA，通過(guò)脂質(zhì)體法將其轉(zhuǎn)染入骨肉瘤細(xì)胞株。使用RT-PCR和Western-bloting實(shí)驗(yàn)方法檢驗(yàn)其對(duì)ROR2基因及蛋白表達(dá)水平的影響。
　　 結(jié)果：①通過(guò)測(cè)序和酶切證實(shí)成功構(gòu)建了針對(duì)ROR2的小干擾RNA；②通過(guò)RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了干擾前后SaoS-2骨肉瘤細(xì)胞株中R

14、OR2基因表達(dá)情況，轉(zhuǎn)染后干擾組ROR2 mRNA的表達(dá)水平(0.19±0.02)明顯低于陰性對(duì)照組(0.55±0.04)和空白組(0.58±0.04)，干擾組和陰性對(duì)照組比較有顯著性差異(t=13.71，P<0.05)，干擾組和空白組比較有顯著性差異(t=14.86，P<0.05)，而空白組和陰性對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(t=1.24，P>0.05)。⑨通過(guò)Western-bloting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了干擾前后SaoS-2骨肉瘤細(xì)胞株中ROR

15、2蛋白表達(dá)情況，轉(zhuǎn)染后干擾組ROR2蛋白的表達(dá)水平(0.18±0.03)明顯低于陰性對(duì)照組(0.66±0.04)和空白組(0.84±0.03)，干擾組和陰性對(duì)照組比較有顯著性差異(t=7.61，<0.05)，干擾組和空白組比較有顯著性差異(t=6.37，P<0.05P)，而空白組和陰性對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(t=0.31，P>0.05)。
　　 結(jié)論：①成功地合成了ROR2 siRNA并將其轉(zhuǎn)染入SaoS-2骨肉瘤細(xì)胞；②在國(guó)內(nèi)

16、首次發(fā)現(xiàn)ROR2 siRNA能下調(diào)SaoS-2骨肉瘤細(xì)胞ROR2基因和蛋白的表達(dá)水平。
　　 第三部分：ROR2對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖及侵襲力的作用。
　　 目的：研究ROR2對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖及侵襲力的影響，證實(shí)其在骨肉瘤中的生物學(xué)作用
　　 方法：通過(guò)細(xì)胞流式檢驗(yàn)、Brdu標(biāo)記實(shí)驗(yàn)和transwell侵襲實(shí)驗(yàn)了解ROR2 RNA干擾后骨肉瘤細(xì)胞增殖和侵襲力的變化。
　　 結(jié)果：①細(xì)胞流式檢測(cè)示RNAi后干擾組

17、細(xì)胞中S期細(xì)胞所占百分比(12.40±4.85)明顯低于陰性對(duì)照組(31.23±2.21)和空白組(26.50±2.07)，干擾組和陰性對(duì)照組比較有顯著性差異(t=6.12，P<0.05)，干擾組和空白組比較有顯著性差異(t=4.63，P<0.05)，而空白組和陰性對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(t=2.71，P>0.05)。RNAi后干擾組細(xì)胞中G1期細(xì)胞所占百分比(81.47±6.56)明顯高于陰性對(duì)照組(57.87±4.65)和空白組(6

18、3.07±4.92)，干擾組和陰性對(duì)照組比較有顯著性差異(t=5.09，P<0.05)，干擾組和空白組比較有顯著性差異(t=3.86，P<0.05)，而空白組和陰性對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(t=1.32，P>0.05)。②Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)示RNAi后干擾組侵襲細(xì)胞數(shù)(20.40±11.93)明顯低于陰性對(duì)照組(37.80±6.83)和空白組(44.00±7.81)，干擾組和陰性對(duì)照組比較有顯著性差異(t=3.70，P<0.05)

19、，干擾組和空白組比較有顯著性差異(t=2.83，P<0.05)，而空白組和陰性對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(t=1.34，P>0.05)。③Brdu標(biāo)記實(shí)驗(yàn)結(jié)果示RNAi后干擾組標(biāo)記指數(shù)(0.14±0.03)明顯低于陰性對(duì)照組(0.32±0.02)和空白組(0.28±0.03)，干擾組和陰性對(duì)照組比較有顯著性差異(t=5.18，P<0.05)，干擾組和空白組比較有顯著性差異(t=6.70，P<0.05)，而空白組和陰性對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(