諾如病毒熒光定量檢測(cè)方法的建立及氯滅活諾如病毒消毒規(guī)律研究.pdf

1、研究目的:
　　諾如病毒(Norovirus,NoV)是一種引起世界范圍內(nèi)非細(xì)菌性急性胃腸炎的主要病毒,是杯狀病毒家族的主要成員,能夠引起急性腹瀉、嘔吐的發(fā)生,重者可因脫水死亡或自身免疫缺陷導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥危及生命。從二十世紀(jì)九十年代至今,NoVGII.4已經(jīng)逐漸成為了世界范圍內(nèi)的優(yōu)勢(shì)流行株,并且造成了至少四次全球性的疾病流行。NoV主要通過(guò)糞口途徑傳播,食用被病毒污染的食物、人與人的接觸、食用牡蠣、飲水都可以傳播該病毒,其次通過(guò)

2、呼吸道吸入飛揚(yáng)的嘔吐物微粒也可能是一種傳播途徑。諾如病毒在環(huán)境中高度穩(wěn)定,但是對(duì)人卻極易感染,因此也是污染飲用水導(dǎo)致腹瀉疾病流行的重要病因。上個(gè)世紀(jì)七十年代,通過(guò)電鏡發(fā)現(xiàn)了NoV,目前,由于缺乏組織細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng),對(duì)于NoV的消毒機(jī)理的研究通常采用替代病毒來(lái)進(jìn)行,例如:鼠NoV(murinenorovirus,MNV)、貓杯狀病毒(felinecalicivirus,FeCV)和犬杯狀病毒(caninecalicivirus,CaCV)。

3、因此,調(diào)查研究我國(guó)NoV的流行現(xiàn)況,建立快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法,為制定相應(yīng)的控制策略和措施提供依據(jù);對(duì)該病毒進(jìn)行消毒研究,可以更好地提供污水消毒指導(dǎo)方案,進(jìn)一步保證在污水凈化過(guò)程中的細(xì)菌學(xué)和病毒學(xué)安全指標(biāo)的達(dá)成。因此,本課題通過(guò)RT-PCR方法研究2009年10～11月天津市兒童醫(yī)院的腹瀉嬰幼兒NoV的流行情況,建立和評(píng)價(jià)NoV基因II型的熒光定量RT-qPCR檢測(cè)方法,采用氯對(duì)水中NoV的消毒進(jìn)行初步研究,為污水中NoV的污染檢測(cè)、消毒

4、控制和突發(fā)公共衛(wèi)生事件的快速檢測(cè)提供參考方法和依據(jù)。
　　研究方法:
　　收集天津市2009年10～11月兒童醫(yī)院門(mén)診部和住院部急性腹瀉患兒糞便標(biāo)本319例,其中男198例、女121例,最小年齡為出生后兩天,最大為9歲。通過(guò)RT-PCR方法確定NoV核酸陽(yáng)性的標(biāo)本,將PCR擴(kuò)增樣本交由公司純化測(cè)序,樣本序列結(jié)果經(jīng)過(guò)編輯與Genbank中公布的基因進(jìn)行Blast序列比較,從而判斷樣本的基因型。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,從Genbank下載

5、NoV各型參考株序列。應(yīng)用Bioedit軟件進(jìn)行核苷酸多序列分析比對(duì),利用MEGA4.1軟件鄰位相連法繪制系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析樣本的人口學(xué)資料和臨床資料。
　　采用RT-PCR檢測(cè)NoVGII強(qiáng)陽(yáng)性的樣本,PCR產(chǎn)物純化后克隆轉(zhuǎn)化,藍(lán)白斑陽(yáng)性克隆篩選,構(gòu)建質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)錄合成copyRNA(cRNA)作為標(biāo)準(zhǔn)品,建立和優(yōu)化了NoV基因II型熒光定量RT-qPCR方法和反應(yīng)體系,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,評(píng)價(jià)該反應(yīng)體系的靈敏度、特異性、重

6、復(fù)性,并進(jìn)行臨床糞便樣本的檢測(cè)評(píng)價(jià)。
　　以NoV為研究對(duì)象,采用不同濃度的氯(1mg/L、2mg/L、3mg/L、5mg/L、10mg/L)消毒劑處理水中的NoV,使用三對(duì)引物對(duì)NoV的滅活情況進(jìn)行評(píng)價(jià),其中自行設(shè)計(jì)分別針對(duì)NoV的5’端、3’端的引物,以及ORF1-ORF2結(jié)合區(qū)的引物參照文獻(xiàn)(見(jiàn)第一章)。PH7.2,室溫下,不同時(shí)間點(diǎn)取樣,通過(guò)RT-PCR探索氯對(duì)NoV基因損傷位點(diǎn),采用熒光定量PCR方法進(jìn)一步檢測(cè)氯消毒過(guò)程

7、中NoV的核酸減少量。初步研究氯對(duì)NoV的滅活情況。
　　研究結(jié)果:
　　一、2009年10～11月天津市兒童醫(yī)院腹瀉患兒糞便標(biāo)本中NoV的檢出情況
　　經(jīng)過(guò)RT-PCR檢測(cè)的319例標(biāo)本中,共檢出60例NoV陽(yáng)性。RT-PCR檢測(cè)表明,有59例為NoVGII型,有1例為NoVGI型,構(gòu)成比分別為98.3％和1.7%。
　　24例NoV陽(yáng)性標(biāo)本PCR產(chǎn)物純化和測(cè)序,測(cè)序結(jié)果利用bioedit編輯后提交Genban

8、k進(jìn)行BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn),1例是NoVGI型,其余的23例均為NoVGII型。
　　多序列同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn),測(cè)序毒株17株與荷蘭的Nijmegen115參考株、LincolnHouse參考株、Beijing151株和Terneuzen70株序列同源性為71.7～99.3%,與LincolnHouse參考株同源性高達(dá)98.0～99.3%。15例GII-4型中13例是2006b變異株;2例是GII-3型。系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)分析顯示,2009年天

9、津市腹瀉患兒NoV以NoVGII/2006b毒株為主要的流行株,這與我國(guó)其他地方目前的研究相似,這表明,目前我國(guó)的流行優(yōu)勢(shì)株仍然是NoVGII/2006b毒株。
　　不同年齡組NoV陽(yáng)性的病例分布情況分析表明,60例感染患兒中,0～1歲年齡組的患兒感染NoV35例,1～2歲患兒感染NoV16例,隨著年齡的增大,腹瀉患兒減少,感染NoV的兒童也較少。嬰幼兒NoV的感染主要是集中于0～2歲人群。
　　本研究中門(mén)診腹瀉患兒NoV的

10、陽(yáng)性率是26.75%(41/157),而住院部腹瀉患兒NoV的陽(yáng)性率是11.11%(18/162),統(tǒng)計(jì)學(xué)分析二者差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明該病發(fā)病急,自限性,恢復(fù)快,大多數(shù)病人選擇門(mén)診就醫(yī)。
　　二、NoV基因II型熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立和評(píng)估
　　NoVGII熒光定量RT-PCR擴(kuò)增所使用的引物進(jìn)行普通RT-PCR反應(yīng),2%的瓊脂糖凝膠電泳顯示,在98bp處有特異性條帶,沒(méi)有其他非特異性擴(kuò)增。該引物和探針熒光定量

11、RT-PCR檢測(cè)熒光擴(kuò)增曲線呈典型的光滑的S型曲線。
　　構(gòu)建的質(zhì)粒DNA的純度好,濃度高,經(jīng)過(guò)體外轉(zhuǎn)錄純化得到cRNA,cRNA的OD值位于1.7～2.0中間,純度較好,濃度均值為321.83μg/ml。標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率是-3.41,截距是49.79,相關(guān)系數(shù)(R2)是0.998。
　　此方法經(jīng)過(guò)靈敏度檢測(cè),結(jié)果顯示敏感性好,最低可以檢出102拷貝數(shù)/μl的已知濃度RNA標(biāo)準(zhǔn)品樣本。
　　此方法能夠特異地檢出NoV基因

12、II型,與NoVGI型無(wú)交叉反應(yīng),與柯薩奇病毒B組、脊髓灰質(zhì)炎病毒、腸道病毒、星狀病毒、甲肝病毒、?？刹《竞洼啝畈《緹o(wú)交叉反應(yīng)。
　　針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的批內(nèi)試驗(yàn)的Ct值變異系數(shù)(CV)分別為1.60%、0.70%,批間試驗(yàn)的變異系數(shù)(CV值)分別為0.40%、0.40%,均在5%以下,說(shuō)明該體系穩(wěn)定,重復(fù)性良好。
　　三、氯對(duì)水中NoV的消毒研究
　　RT-PCR結(jié)果顯示,NV3R/NV3F引物對(duì)擴(kuò)增條帶最先消失;其次,隨著

13、氯的消毒劑量增大,COG2F/G2-SKR引物對(duì)擴(kuò)增條帶消失;而后,當(dāng)氯的消毒劑量從5mg/L到10mg/L時(shí),NV5R/NV5F引物對(duì)擴(kuò)增條帶消失。由此,我們認(rèn)為,在三個(gè)不同的擴(kuò)增中,消毒劑液氯可能優(yōu)先損傷了NoV核酸的3’端,之后是ORF1與ORF2的結(jié)合區(qū),而后損傷了5’端。
　　PH7.2,室溫下,濃度為1mg/L的氯作用下,基于引物COG2F/G2-SKR的熒光定量PCR檢測(cè)顯示,NoV的減少率在20min達(dá)到2.16l

14、og10。隨著氯濃度的增加,在氯濃度5mg/L的時(shí)候NoV的減少率在5min可達(dá)到2.24log10,在20min達(dá)到3.01log10。
　　結(jié)論:
　　1、2009年10～11月天津市兒童醫(yī)院腹瀉患兒中存在NoV所致的病毒性腹瀉,并且NoV是導(dǎo)致腹瀉的主要病原體;腹瀉患兒存在不同基因型別的NoV感染,NoVGII-4的2006b變異株是主要的流行優(yōu)勢(shì)株。
　　2、我們建立和優(yōu)化了熒光定量RT-PCR檢測(cè)NoVGII