瘦素經(jīng)Cdk5途徑改善阿爾茨海默病樣tau蛋白過(guò)度磷酸化的研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一種神經(jīng)退行性疾病,以神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle,NFT)和老年斑(senile plaque,SP)為主要病理特征,其中神經(jīng)纖維纏結(jié)的本質(zhì)是過(guò)度磷酸化的tau堆積。AD的病因和發(fā)病機(jī)制迄今尚不清楚,臨床上也缺乏有效藥物,因此有關(guān)發(fā)病機(jī)制以及新的藥物作用靶點(diǎn)的探索,一直是研究的熱點(diǎn)。
　　瘦素(Leptin)是一種中樞性能量代謝調(diào)節(jié)因子,

2、在炎癥反應(yīng)和創(chuàng)傷修復(fù)方面也具有重要功能,有關(guān)其神經(jīng)保護(hù)作用的研究也引起廣泛關(guān)注。為了解leptin在擬AD樣損傷中的作用及其分子機(jī)制,本研究擬用岡田酸(okadaic acid,OA)作為誘導(dǎo)劑建立神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(SH-SY5Y)AD模型、原代海馬神經(jīng)元AD模型及器官型腦片AD模型,探討leptin對(duì)擬AD樣損傷的調(diào)節(jié)及其作用機(jī)制,并在AD患者尸檢腦組織切片中觀察病理改變。
　　本研究包括下述4個(gè)部分:第一部分Leptin通過(guò)

3、抑制Cdk5(細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶5)在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系tau過(guò)度磷酸化中發(fā)揮的保護(hù)作用;第二部分Leptin在原代海馬神經(jīng)元tau過(guò)度磷酸化中的神經(jīng)保護(hù)作用及可能的分子機(jī)制;第三部分Leptin在器官型腦片擬AD樣模型中發(fā)揮的神經(jīng)保護(hù)作用;第四部分AD患者尸檢腦組織海馬區(qū)病理觀察及檢測(cè)。
　　結(jié)果如下:
　　1.在SH-SY5Y細(xì)胞系水平上建立擬AD樣細(xì)胞模型
　　(1)OA作為誘導(dǎo)劑處理細(xì)胞,可成功建立ta

4、u蛋白過(guò)度磷酸化的擬AD樣細(xì)胞模型;400ng/mL leptin處理細(xì)胞6h顯著增加細(xì)胞活力,說(shuō)明leptin對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用;
　　(2)免疫熒光雙染法顯示,ObR與Cdk5、ObR與p-tau均存在共表達(dá),提示ObR與二者之間均有可能存在相互作用;
　　(3)leptin能夠劑量依賴性地降低p-tau蛋白水平,并顯著下調(diào)Cdk5(導(dǎo)致tau蛋白過(guò)度磷酸化的直接因素)表達(dá),ObR特異性封閉劑則可以逆轉(zhuǎn)上述作用,說(shuō)明lep

5、tin與其受體結(jié)合通過(guò)抑制Cdk5表達(dá)來(lái)降低p-tau水平;
　　(4)SiRNA沉默Cdk5表達(dá)可降低p-tau,而Cdk5的化學(xué)抑制劑Roscovitine則不能達(dá)到這一效果。
　　2.在原代海馬神經(jīng)元水平上建立擬AD樣細(xì)胞模型
　　(1)AD主要病變區(qū)域集中在海馬組織,該部分使用原代海馬神經(jīng)元旨在表現(xiàn)leptin對(duì)病變位置細(xì)胞的保護(hù)作用。模型建立后,ObRbmRNA表達(dá)顯著升高,提示AD模型中l(wèi)eptin可能通過(guò)

6、其長(zhǎng)型受體發(fā)揮效應(yīng);
　　(2)與細(xì)胞系水平一致,在原代神經(jīng)元中l(wèi)eptin顯著降低Cdk5及p-tau表達(dá),ObR特異性封閉劑則可以逆轉(zhuǎn)上述作用;SiRNA使Cdk5沉默可降低p-tau,而Cdk5化學(xué)抑制劑Roscovitine則不能;
　　(3)OA誘導(dǎo)模型后ERK1/2(細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2)過(guò)度激活,而leptin可以下調(diào)其活化;利用ERK的特異性抑制劑U0126,則可以下調(diào)Cdk5及p-tau;說(shuō)明ERK1/

7、2在leptin對(duì)擬AD樣損傷的保護(hù)作用中發(fā)揮了重要作用;
　　(4)Cdk5的抑制劑Roscovitine上調(diào)ERK1/2的活化,在3h-6h期間達(dá)到頂峰,6h以后至12h開(kāi)始降低,這可以解釋其為何不能降低p-tau水平。
　　3.在器官型腦片水平上建立擬AD樣組織模型
　　(1)器官型腦片屬組織水平,能夠更好的模擬組織中細(xì)胞間的相互影響,更貼近體內(nèi)環(huán)境。Real-timePCR顯示,OA誘導(dǎo)后,ObRbmRNA表達(dá)

8、顯著升高;
　　(2)與細(xì)胞水平一致,leptin顯著降低p-tau及Cdk5表達(dá),ObR特異性封閉劑則可以逆轉(zhuǎn)上述作用;Cdk5SiRNA處理可降低p-tau,而Cdk5抑制劑Roscovitine則不能。
　　4.AD患者尸檢腦組織病理改變
　　(1)尸檢組織病理切片能夠很直觀地觀察到AD患者海馬組織的病變情況,結(jié)果最為真實(shí)。HE染色顯示,細(xì)胞排列紊亂,可見(jiàn)大量細(xì)胞變性、壞死,胞漿疏松,有明顯空泡樣顆粒變性,空泡內(nèi)

9、細(xì)胞體積明顯縮小;
　　(2)免疫熒光雙染法顯示,病變區(qū)域ObR與Cdk5、ObR與p-tau存在共定位且熒光強(qiáng)度均較高,而正常區(qū)域則均較低;
　　(3)免疫組化結(jié)果顯示,ObR在病變區(qū)域中分布較廣泛,而正常組織則較少。Cdk5、p-tau蛋白陽(yáng)性細(xì)胞多分布于空泡狀結(jié)構(gòu),正常組織中分布較少。
　　綜上所述,本研究表明:
　　(1)外源性leptin能夠通過(guò)與其長(zhǎng)型受體ObRb結(jié)合,在擬AD樣tau過(guò)度磷酸化損傷中

10、發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用;
　　(2)Leptin在OA誘導(dǎo)的AD模型中,顯著降低Cdk5表達(dá),降低tau過(guò)度磷酸化水平;
　　(3)AD發(fā)生過(guò)程中,ERK1/2過(guò)度激活,外源性leptin可以下調(diào)其活化;
　　(4)抑制ERK1/2可以起到下調(diào)Cdk5及p-tau水平的作用;
　　(5)SiRNA直接干擾Cdk5基因可以起到下調(diào)p-tau的作用,而其化學(xué)抑制劑由于會(huì)激活ERK1/2不能達(dá)到這一效果。
　　(6)A