制備工藝對滸苔多糖初級結構和降血糖作用的影響.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  研究不同制備工藝對滸苔多糖(Enteromorpha’s polysaccharide,EP)初級結構的影響;研究滸苔多糖分離純化的條件;研究不同制備工藝所得滸苔多糖降血糖的作用;研究滸苔多糖初級結構與其降血糖作用的關系。
  方法:
  1、以福建沿海所產滸苔為實驗材料,分別采用超聲波輔助制備法或纖維素酶法制備滸苔多糖,兩者多糖提取液,均通過離心去渣,通過中性蛋白酶去除蛋白質,通過透析袋去除鹽類物質,通過

2、DA201樹脂去除色素后,采用醇沉法結合凍干工藝得到超聲波法制備的滸苔粗多糖UEP(EP by ultrasonic)和纖維素酶法制備的滸苔粗多糖EEP(EP by enyzme)。
  2、采用DEAE-52纖維素和Sephadex-100凝膠分離純化滸苔粗多糖,得到UEP的主成分UEP1和EEP的主成分EEP1。對UEP1和EEP1進行結構分析,用液相色譜分析分子量,用氣相色譜分析單糖組成,用紅外線光譜分析功能團;用苯酚硫酸法

3、測定多糖含量,用硫酸鋇比濁法測定硫酸根含量,用間羥基聯苯法測定糖醛酸含量。
  3、以Hep G2細胞為實驗對象,采用胰島素和二甲雙胍作為陽性對照組,觀察UEP1和EEP1是否能降低葡萄糖。
  4、建立胰島素抵抗模型,采用二甲雙胍作為陽性對照組,觀察UEP1和EEP1是否能降低培養(yǎng)基內葡萄糖含量,并通過逆轉錄多聚酶鏈式反應(RT-PCR)測定肝細胞核因子(HNFs)家族、胰島素受體(IR)和葡萄糖轉運體(GLUTs)家族m

4、RNA的表達水平。
  結果:
  1、滸苔多糖的制備及分離純化
  UEP和EEP均為淡綠色粉末狀固體,不溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑。水溶性較差,在水中的最大溶解度為40mg/mL。
  UEP、EEP經分離純化,均得到五個組分,且都以第一個組分為主成分。UEP五個組分摩爾比為146:27:40:3:1,主成分UEP1占UEP的67.28%,回收率為98.85%;EEP五個組分摩爾比為89:18.5:27:

5、8.5:1,主成分EEP1占EEP的61.80%?;厥章蕿?9.12%。
  UEP1和EEP1均為白色粉末狀固體,不溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑。UEP1、EEP1較UEP、EEP水溶性降低,在水中的最大溶解度為20mg/mL。滸苔多糖水溶液可形成凝膠,且這種溶液——凝膠的轉變現象是熱可逆的。
  2、滸苔多糖結構和成分分析
  UEP1和EEP1均是α-吡喃型多糖,富含硫酸基團,不含蛋白質,且含有糖醛酸、羧酸、醚

6、鍵;含有鼠李糖(Rha)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal),以Rha含量最高。
  但UEP1和EEP1的初級結構不完全相同。UEP1中Rha、Xyl、Man、Glu、Gal的摩爾比為3.96:1.09:0.24:0.34:0.16;EEP1中 Rha、Xyl、Man、Glu、Gal的摩爾比為3.08:1:0.17:0.30:0.11。UEP1平均分子量為179547,EEP1平均分子量為520

7、160。UEP1多糖含量為98.59%,EEP1為97.09%。UEP1硫酸根含量為17.74%,EEP1為20.71%。UEP1糖醛酸含量為22.20%,EEP1為21.76%。
  3、不同制備工藝的滸苔多糖降血糖效果及機制研究
  Hep G2細胞葡萄糖消耗試驗結果,與空白組(Blank)比較,陽性對照組1(即胰島素組,Insulin)、陽性對照組2(二甲雙胍組,Metformin)、UEP1由高到低四個劑量組(HUE

8、P1、MUEP1、LUEP1、SUEP1)、EEP1由高到低四個劑量組(HEEP1、MEEP1、LEEP1、SEEP1)均較高(P<0.05);與陽性對照組Metformin比較,Blank、LUEP1、SUEP1、SEEP1的葡萄糖消耗量(GC)較低(P<0.05),Insulin、HEEP1、MEEP1的GC較高(P<0.05);與陽性對照組Insulin組比較,Blank、Metformin、MUEP1、LUEP1、SUEP1、S

9、EEP1的GC較低(P<0.05),MEEP1的GC較高(P<0.05)。比較UEP1降血糖最佳濃度HUEP1與EEP1降血糖最佳濃度MEEP1,發(fā)現MEEP1降血糖效果優(yōu)于HUEP1,差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
  實驗建立了胰島素抵抗模型,以1×10-3mmol/L胰島素作用36小時后開始產生胰島素抵抗,60小時內模型穩(wěn)定。油紅O染色可見胰島素抵抗模型鮮紅色脂滴明顯增多。實驗發(fā)現與空白對照組Blank比較,模型組(Mo

10、del)、UEP1各劑量組、EEP1各劑量組的GC較低(P<0.05);與模型組Model比較,其它組GC均較高(P<0.05);與陽性對照組Metformin比較,Model、HUEP1、MUEP1、LUEP1、SUEP1、LEEP1、SEEP1的GC較低(P<0.05)。比較UEP1降血糖最佳濃度HUEP1與EEP1降血糖最佳濃度HEEP1,發(fā)現HEEP1降血糖效果優(yōu)于HUEP1,差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
  觀察U

11、EP1和EEP1各基因的表達量:①HNF4α:與Blank比較,各實驗劑量組均較低(P<0.05);與模型組Model對比,各實驗劑量組均較高(P<0.05);與陽性對照組Metformin對比,MUEP1、LUEP1、SUEP1、MEEP1、LEEP1、SEEP1表達量較低。②HNF1α:與Blank對比,各實驗劑量組均較低(P<0.05);與模型組Model對比,Metformin、HUEP1、MUEP1、HEEP1、MEEP1、L

12、EEP1表達量較高(P<0.05);與陽性對照組Metformin對比,MUEP1、LUEP1、SUEP1、LEEP1、SEEP1表達量較低(P<0.05)。③HNF1β:與Blank對比,各實驗劑量組均較低(P<0.05);與模型組Model對比,Metformin、HUEP1、MUEP1、LUEP1、HEEP1、MEEP1、LEEP1、SEEP1表達量較高(P<0.05);與陽性對照組Metformin對比,MUEP1、LUEP1、

13、SUEP1、MEEP1、LEEP1、SEEP1表達量較高(P<0.05)。④HNF6:與Blank對比,各實驗劑量組均較低(P<0.05);與模型組Model對比,各實驗劑量組均較高(P<0.05);與陽性對照組Metformin對比,LUEP1、SUEP1、MEEP1、LEEP1、SEEP1表達量較低(P<0.05)。⑤IR:與Blank對比,在各實驗劑量組均較低(P<0.05);與模型組Model對比,各實驗劑量組均較高(P<0.0

14、5);與陽性對照組Metformin對比,HEEP1表達量較高,LUEP1、SUEP1、LEEP1、SEEP1表達量較低(P<0.05)。⑥GLUT4:與Blank對比,各實驗劑量組均較低(P<0.05);與模型組Model對比,實驗劑量組均較高(P<0.05);與陽性對照組Metformin對比,HUEP1、MUEP1、HEEP1表達量較高(P<0.05)。⑦GLUT2:與Blank對比,各實驗劑量組中均較高(P<0.05);與模型組

15、Model對比,各實驗劑量組均較高(P<0.05);與陽性對照組Metformin對比,EP各劑量組表達量均較低(P<0.05)。
  比較UEP1和EEP1各基因表達量:對比HNF6中UEP1最佳濃度HUEP1與EEP1最佳濃度HEEP1,HUEP1優(yōu)于HEEP1(P<0.05),對比IR中UEP1最佳濃度HEEP1與EEP1最佳濃度HUEP1,HEEP1優(yōu)于HUEP1(P<0.05)。其余HNF4α、HNF1α、HNF1β、G

16、LUT4、GLUT2中UEP1最佳濃度與EEP1最佳濃度差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
  結論:
  1、兩種不同制備工藝對滸苔多糖的初級結構及其降血糖作用均有一定的影響,但其主體結構和主要功能無變化。
  2、UEP和EEP分離純化后均可分為五個組分,以第一組分為主。UEP1和EEP1均是α-吡喃型多糖,富含硫酸基團,是由不同大小多糖分子組成的混合體。兩者均以Rha為主,還有Xyl、Man、Glu、Gal。但其

17、結構并不完全相同,UEP1平均分子量小于EEP1;UEP1含有Rib、Fuc,而EEP1沒有,且單糖摩爾構成比不同;UEP1多糖含量高于EEP1;硫酸根含量低于EEP1;糖醛酸含量高于EEP1。
  3、采用胰島素1×10-3mmol/L作用于HepG2細胞36h建立胰島素抵抗模型,經油紅O染色鑒定,模型細胞鮮紅色脂滴增多,正常細胞僅見少量脂滴。RT-PCR結果顯示HNFs、IR、GLUT4表達量下調,GLUT2表達量上調,模型在

18、60h內穩(wěn)定,可用于研究藥物對2型糖尿病的作用。
  4、UEP1和EEP1均具有降血糖的功效,且作用效果可能優(yōu)于胰島素、二甲雙胍。在實驗劑量范圍內,EEP1降血糖的作用優(yōu)于UEP1,這可能與EEP1的分子量大于UEP1有關,可能與其能夠更多的上調胰島素受體的數目有關。
  5、EP改善胰島素抵抗模型可能的機制有:①通過上調肝細胞核因子HNFs的表達量;②通過上調IR的表達量;③通過上調GLUT4的表達量;④通過下調GLUT

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