雞堆型艾美耳球蟲Hsp90增強型核酸疫苗免疫保護研究.pdf

1、雞球蟲病(Coccidiosis)是由艾美耳科，艾美耳屬（Eimeria）的一種或幾種雞艾美耳球蟲引起的以腸道感染為主的細胞內(nèi)原蟲病，雞球蟲寄生于各段腸道引起發(fā)病，導(dǎo)致腹瀉、便血和體重降低，對養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。目前對雞球蟲病的防治主要以藥物為主，但由于容易出現(xiàn)耐藥性及藥物殘留，使得一些藥物難以發(fā)揮其有效的作用。目前，安全而有效的基因工程疫苗用于雞球蟲病的防治已成為研究熱點?；蚬こ桃呙绾蜻x基因的選擇至關(guān)重要,Hsp90家族是分子

2、大小質(zhì)量81～99 Ku的一種進化保守的蛋白質(zhì)，在分子伴侶功能、細胞循環(huán)調(diào)控、抗原傳遞方面發(fā)揮著重要作用，已有研究表明其與多種寄生蟲生長發(fā)育過程關(guān)系密切。
　　本研究根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的堆型艾美耳球蟲（E.acervulina）Hsp90基因序列設(shè)計一對特異性引物，通過RT-PCR方法從E.acervulina子孢子中成功克隆得到大小為2433 bp的Hsp90基因序列，其中包含一段大小為2139 bp的開放性閱讀框，編碼713個氨基酸

3、殘基，蛋白分子質(zhì)量大小為82.5 Ku，將ORF通過多克隆位點插入pET-30a(+)空載體中，成功構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒pET30a-Hsp90，轉(zhuǎn)化入E.coli Rosetta感受態(tài)細胞并經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，通過SDS-PAGE及His單抗Western-blot檢測，結(jié)果顯示一個大小為89 Ku的可溶性融合蛋白得以高效表達。以純化的Hsp90蛋白免疫新西蘭大白兔制各兔抗Hsp90多克隆抗體，間接ELISA和Western-blot檢測表

4、明其反應(yīng)性和特異性良好。
　　通過利用一段抗原性小的柔性片段(G4S)3多肽linker，將Hsp90與ChIL-18基因連接后構(gòu)建pVAX-Hsp90及pVAX-IL18-Hsp90重組真核表達質(zhì)粒，體外瞬時轉(zhuǎn)染BHK21細胞進行IFA檢測，結(jié)果顯示Hsp90及IL-18均可在體外成功表達，可較好的發(fā)揮其免疫原性并用于后續(xù)動物免疫保護實驗。實驗雞分為5組，分別為未免疫未攻蟲組（N組）、PBS注射攻蟲組(P組)、pVAX1質(zhì)粒注射

5、組（E組）、pVAX-Hsp90質(zhì)粒免疫組（H組）、pVAX-IL18-Hsp90質(zhì)粒免疫組（I組）。實驗組分別以100μL/雞的PBS或100μg/雞的pVAX1、pVAX-Hsp90或pVAX-IL18-Hsp90劑量于14d和21d胸部肌肉注射免疫雛雞，在二次免疫后每只雞口服接種1×105個孢子化卵囊。檢測不同處理組雛雞淋巴細胞增殖功能變化、血清抗體IgG變化、增重情況、十二指腸病變計分、OPG及抗球蟲指數(shù)等各項指標(biāo)，用以評價真核

6、表達質(zhì)粒的免疫保護效果，結(jié)果表明兩個實驗組各項指標(biāo)均優(yōu)于對照組，且Ⅰ組數(shù)值均高于H組;H組與Ⅰ組的淋巴細胞增殖活性在免疫后顯著升高;ELISA方法檢測血清抗體IgG顯示，H組與Ⅰ組抗Hsp90血清抗體效價兩次免疫持續(xù)升高，且在35日齡時達到最高值，而對照組未見升高;H組與Ⅰ組綜合抗球蟲指數(shù)值分別為166.17和175.32，均可產(chǎn)生有效的抗球蟲保護，這表明Hsp90是一種潛在的球蟲保護性抗原，且ChIL-18對其免疫效果起到佐劑樣的作用