rPNCE-Lenti1259慢病毒載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染人類胚胎干細(xì)胞.pdf

1、胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）是全能型干細(xì)胞，具有自我更新能力及多向分化潛能。1998年，Thomson等首次成功分離并建立人胚胎干細(xì)胞系。將人類ES細(xì)胞定向誘導(dǎo)成為胰島終末分化細(xì)胞，為糖尿病的細(xì)胞替代治療提供豐富的細(xì)胞來源。但目前還沒有一種理想的方法把胰島終末分化細(xì)胞從混和培養(yǎng)物中分離出來。為了克服這一困難，本研究利用人PDX-1 （pancreatic and duodenal homeobox f

2、actor-1）基因啟動子的兩個核心區(qū)域Area Ⅰ和Area Ⅱ（命名為PDXA12），攜帶新霉素抗性基因（Neomycin resistant gene，Neor），構(gòu)建了 pPDXA12-Neor-pCMV-EGFP-Lenti1259（簡稱為 rPNCE-Lenti1259）重組慢病毒載體。本研究擬分別構(gòu)建pPDXA12-EGFP-C3載體和rPNCE-Lenti1259慢病毒載體；使用慢病毒轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染人類ES細(xì)胞，建立穩(wěn)

3、定轉(zhuǎn)染rPNCE-Lenti1259慢病毒載體的人類ES細(xì)胞系。 研究內(nèi)容及結(jié)果如下：　　 一、成功構(gòu)建了pPDXA12-EGFP-C3重組質(zhì)粒載體及重組載體體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)：以人的基因組DNA為模板，通過PCR法擴(kuò)增人PDXA12啟動子序列，上游5’端引入AseⅠ酶切位點(diǎn)，下游5’端引入NheⅠ酶切位點(diǎn)，膠回收純化PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體16℃進(jìn)行連接。利用基因重組技術(shù)，首先將PDXA12啟動子序列克隆入pEGFP-

4、C3載體。抽提質(zhì)粒，重組載體酶切鑒定、基因測序，選取序列正確的克隆用于體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。pPDXA12-EGFP-C3重組質(zhì)粒載體分別轉(zhuǎn)染NIT-1、HEFs、293FT、hESCs細(xì)胞，在倒置熒光顯微鏡下觀察，只有MT-1細(xì)胞可以看到明亮的綠色熒光，其他三種細(xì)胞均看不到明亮的綠色熒光，說明載體構(gòu)建成功。提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的DNA、RNA，通過PCR、RT-PCR檢測到外源目的基因的整合和表達(dá)，在NIT-1細(xì)胞中DNA和RNA水平均檢測到了EGF

5、P基因的整合和表達(dá)；而在其他三種細(xì)胞中，只有在DNA水平檢測到EGFP基因的整合，而沒有在RNA水平檢測到EGFP基因的表達(dá)。提示PDXA12啟動子能特異地引導(dǎo)EGFP基因在胰島細(xì)胞中表達(dá)?！　?二、成功構(gòu)建了rPNCE-Lenti1259慢病毒載體及重組載體體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)：以pPDXA12-EGFP-C3重組質(zhì)粒為模板，通過PCR法擴(kuò)增PDXA12啟動子序列，上游5端引入XbaⅠ酶切位點(diǎn)，下游5端引入XmaⅠ酶切位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物

6、膠回收純化與pMD19-T載體16℃進(jìn)行連接。利用基因重組技術(shù)，首先將PDXA12啟動子序列克隆入Lenti1259慢病毒載體。抽提質(zhì)粒，重組載體酶切鑒定、基因測序，選取序列正確的克隆用于體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。rPNCE-Lenti1259慢病毒載體分別轉(zhuǎn)染NIT-1、HEFS、293FT、hESCs細(xì)胞，在倒置熒光顯微鏡下觀察，四種細(xì)胞均可看到明亮的綠色熒光，說明載體構(gòu)建成功。然后提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞的DNA、RNA，通過PCR、RT-PCR檢測到外

7、源目的基因的整合和表達(dá)，在NIT-1細(xì)胞中DNA和RNA水平均檢測到了Neor基因的整合和表達(dá)；而在其他三種細(xì)胞中，只有在DNA和RNA水平檢測到Neor基因的整合，而沒有在RNA水平檢測到Neor基因的表達(dá)。提示PDXA12啟動子能特異地引導(dǎo)Neor基因在胰島細(xì)胞中表達(dá)?！　?三、慢病毒方法成功感染人ES細(xì)胞：利用rPNCE-Lenti1259慢病毒載體，與CMV△R8.91及MD.G（vesicular stomatitis

8、 virus glycoprotein，VSVG）共同轉(zhuǎn)染293FT包裝細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后60小時分別收集上清，超速離心，濃縮病毒。用適量PBS重懸病毒，感染人類ES細(xì)胞。由于人ES細(xì)胞培養(yǎng)條件比較苛刻，所以不容易轉(zhuǎn)染外源基因。為了提高慢病毒感染人ES細(xì)胞的效率，本實(shí)驗(yàn)在Matrigel膠鋪皿、293FT的貼壁、改變包裝細(xì)胞的密度、收集病毒上清的培基等方面改進(jìn)感染方法，使慢病毒的感染效率得以改善，由于慢病毒的穩(wěn)定整合效率高，所以這樣的轉(zhuǎn)染效率

9、足夠通過熒光標(biāo)記篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染rPNCE-Lenti1259慢病毒載體的人ES細(xì)胞克隆。然后我們利用EGFP熒光標(biāo)記篩選陽性克隆，經(jīng)過三周的篩選得到了純度較高的轉(zhuǎn)染rPNCE-Lenti1259慢病毒載體的人類ES細(xì)胞陽性克隆。 本研究主要創(chuàng)新點(diǎn)如下：　　 （一）本研究成功克隆了PDXA12啟動子；首次將pEGFP-C3載體、PDXA12啟動子、EGFP有效重組并成功構(gòu)建了pPDXA12-EGFP-C3載體；在細(xì)胞和分

10、子水平對所構(gòu)建的載體進(jìn)行了驗(yàn)證并證明PDXA12啟動子能有效引導(dǎo)EGFP靶基因在胰島細(xì)胞中特異的表達(dá)；　　 （二）首次將慢病毒載體、PDXA12啟動子、新霉素抗性（Neor）基因及EGFP基因有效重組并成功構(gòu)建了rPNCE-Lenti1259重組慢病毒載體；在細(xì)胞和分子水平對所構(gòu)建的載體進(jìn)行了驗(yàn)證并證明PDXA12啟動子能有效引導(dǎo)Neor基因在胰島細(xì)胞中特異的表達(dá)；同時還用rPNCE-Lenti1259重組慢病毒顆粒成功感染了人