SARS冠狀病毒N蛋白和E蛋白特異性細胞免疫記憶及T細胞表位的研究.pdf

1、嚴重急性呼吸綜合征(severeacuterespiratorysyndrome，SARS)是2002年底最先出現(xiàn)在我國廣東省的一種新的傳染性疾病。該病起病急，傳染性強，短短數(shù)月時間內(nèi)全球SARS感染患者確診病例已超過8000例，死亡病例達774例，是一種嚴重危害人民生命健康的嚴重傳染病。現(xiàn)已明確一種新的冠狀病毒為導致SARS的病原體，并命名為SARS冠狀病毒(severeacuterespiratorysyndromecoronavi

2、rus，SARSCoV)。盡管SARS第一次全球爆發(fā)已被控制，但對于SARS的認識不深，目前既無特效的藥物用于治療，又未研制出有效的疫苗用于預防，因此很有必要繼續(xù)深入研究以探索新的防治SARS的方法。 SARS-CoV基因組為單股正鏈RNA，全長約30kb，至少編碼4種主要的結構蛋白：刺突蛋白(Spikeprotein，S)、膜蛋白(Membraneprotein，M)，包膜蛋白(Envelopeprotein，E)和核衣殼蛋白

3、(Nucleocapsidprotein，N)。SARS冠狀病毒的結構蛋白誘導的免疫應答具有保護性作用，但有些蛋白可能會誘導有害的免疫反應和/或炎癥性的反應，導致病理損傷。成功開發(fā)針對SARS的保護性疫苗需要了解不同的免疫系統(tǒng)成分在保護性免疫應答中的作用及鑒定保護性的抗原。表位是與TCR/BCR特異性結合的基本結構單位。大分子抗原一般由多個抗原表位組成，不同的表位誘導的免疫應答不同。因此，鑒定SARS冠狀病毒結構蛋白的表位，有助于開發(fā)針

4、對SARS的免疫防治措施。 疫苗是遏制傳染病的最強有力的手段，而免疫記憶反應的誘導是疫苗成功的基礎。目前對SARS-CoV的免疫記憶的研究主要集中在B細胞免疫記憶上，在所有SARS病人體內(nèi)均可檢測到特異性抗體，其特異性IgG可在體內(nèi)維持至少2年。然而，對人感染SARS-CoV后T細胞的免疫記憶反應知之甚少。病毒感染后免疫保護作用主要由細胞免疫介導，因而探討SARS-CoV感染后T細胞的免疫記憶反應的產(chǎn)生和維持對于設計有效的疫苗極

5、為重要。 N蛋白為病毒體的內(nèi)部蛋白，在SARS病毒的四個結構蛋白中最保守，并且在感染過程中的表達也是最豐富的。對其他冠狀病毒的研究表明N蛋白可誘導產(chǎn)生具有保護作用的細胞免疫應答。因此N蛋白可能是SARS-CoV疫苗研究中最理想的候選抗原。E蛋白是最小的結構蛋白，只有76個氨基酸，主要散布在病毒上，協(xié)同M蛋白參與包膜的形成。由于其在病毒的含量少，一直沒有得到深入的研究。但是近來的研究表明E蛋白作為冠狀病毒的一種膜蛋白具有重要的生物

6、學功能，E蛋白的免疫學研究也不能被忽視。因此，在本論文研究中，我們選擇N和E蛋白作為研究對象，探討其誘導的免疫記憶反應并鑒定了其T細胞表位。 在本論文的第一部分，我們用ELISA和ELIspot方法證明N抗原特異性T細胞免疫記憶反應存在于所有的SARS恢復期病人體內(nèi)，并可維持至少2年。用流式細胞術在SARS病人體內(nèi)證明CD4+和CD8+T細胞均參與SARS-CoVN蛋白特異性免疫記憶反應，但以CD8+T細胞反應為主。CD4+和C

7、D8+記憶T細胞在N抗原的刺激下可迅速產(chǎn)生IFN-γ和IL-2。表型分析表明抗原特異性IFN-γ+CD8+T細胞大部分為TEM表達CD45RA+CCR7-CD62L-，而大部分的IFN-γ+CD4+T細胞為TCM表達CD45RA-CCR7+CD62L-。我們用SARS病人的PBMC對跨越N蛋白全長的57種合成肽進行T細胞表位篩選，結果發(fā)現(xiàn)其中N46(aa331～347)、N47(aa339～354)和N48(aa346～362)能被大多

8、數(shù)SARS病人的T細胞所識別。因此認為N蛋白的第331～362氨基酸區(qū)域是被T細胞識別的優(yōu)勢表位區(qū)，至少含有兩個T細胞表位(N46和N48)。與以前的文獻報道相比較，我們的研究表明SARS-CoV表位特異性的T細胞的頻數(shù)與其他急性病毒感染后的記憶細胞頻數(shù)相當。由于SARS-CoV不存在持續(xù)感染，并且臨床上也從未發(fā)現(xiàn)重復感染，因此可以說SARS病人體內(nèi)N蛋白特異性T細胞免疫記憶的維持是抗原非依賴性的。 在本論文的第二部分，我們用E

9、LISA和ELIspot方法證明E抗原特異性T細胞反應存在于SARS恢復期病人中，并可維持至少2年。用流式細胞術在SARS病人體內(nèi)證明CD4+和CD8+T均參與SARS-CoV的E蛋白特異性免疫記憶反應，并且在E抗原的刺激下可迅速產(chǎn)生IFN-γ和IL-2。表型分析表明E蛋白特異性IFN-γ+CD8+T細胞大部分為TEM表達CD45RO-CCR7-CD62L-，而更多的特異性IFN-γ+CD4+T細胞為TCM表達CD45RO+CCR7+C

10、D62L-。我們用SARS病人的PBMC對跨越E蛋白全長的9種合成肽進行T細胞表位篩選，結果發(fā)現(xiàn)其中E2(aa9～26)、E5(aa33～49)和E6(aa40～57)能被大多數(shù)SARS病人的T細胞所識別。因此認為E2(aa9～26)、E5和E6(aa33～57)是E蛋白中被T細胞優(yōu)先識別的區(qū)域，至少含有兩個T細胞表位。SARS-CoVE蛋白特異性的記憶T細胞的頻數(shù)低于N蛋白表位特異性的記憶細胞頻數(shù)，表明E蛋白的抗原性較弱。 本