2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、背景: 抗體技術(shù)已經(jīng)由細(xì)胞工程抗體發(fā)展到了基因工程抗體。噬菌體抗體、多肽庫、肽庫技術(shù)的出現(xiàn)及噬菌體抗體、多肽的研制成功已成為抗體研究領(lǐng)域的突破性進(jìn)展之一,該技術(shù)被譽(yù)為抗體技術(shù)的第三次革命。 噬菌體抗體、多肽庫(phage antibody library)技術(shù)是通過PCR方法將全套抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)基因克隆出來,克隆至噬菌粒載體上,抗體片段與噬菌體的外殼蛋白以融合蛋白的形式表達(dá)在噬菌體的表面。噬菌體展示技術(shù)建立隨機(jī)肽庫

2、的方法是:通過化學(xué)合成的方法,隨機(jī)合成特定長度肽的寡核苷酸片段,然后通過基因工程重組技術(shù)插入至噬菌體載體的外殼蛋白編碼基因中并轉(zhuǎn)化大腸桿菌,增殖和產(chǎn)生的噬菌體其表面攜帶有外源多肽,每個噬菌體表面表達(dá)一種外源肽,所有這些噬菌體構(gòu)成隨機(jī)肽庫。利用目標(biāo)分子從整個噬菌體隨機(jī)肽庫中經(jīng)篩選—擴(kuò)增—篩選等步驟,最后獲得能與靶分子高親和力結(jié)合的噬菌體克隆。通過測定該噬菌體的DNA序列后,就可知道噬菌體所攜帶的多肽氨基酸序列。 噬菌體抗體、肽庫技

3、術(shù)由兩大核心內(nèi)容組成:①利用絲狀噬菌體或噬菌粒作為表達(dá)載體,通過基因工程重組技術(shù)將外源隨機(jī)合成的DNA片段插入噬菌體外殼蛋白編碼基因中,并在噬菌體表面展示該外源DNA所編碼的多肽;②利用目標(biāo)靶分子如抗體、受體蛋白等,在噬菌體隨機(jī)肽庫中與展示在噬菌體表面的多肽發(fā)生特異性結(jié)合,再通過有效的親和淘選方法,篩選出高親和力結(jié)合多肽的表達(dá)噬菌體。因?yàn)樵谑删w表面表達(dá)的抗體、多肽片段具有與抗原結(jié)合的生物學(xué)活性,因此,可以用親和層析的方法從噬菌體抗體、

4、多肽庫中篩選出目的噬菌體抗體、多肽,并可獲得特異性噬菌體抗體、多肽的基因。獲得目的噬菌體可感染合適的大腸桿菌進(jìn)行分泌型表達(dá),再采用蛋白質(zhì)L—瓊脂糖通過親和層析方法純化出具有與抗原結(jié)合活性的單鏈抗體。這一技術(shù)將抗體的表型和基因型聯(lián)系起來,因而使識別抗原的能力與進(jìn)行再擴(kuò)增的能力結(jié)合在一起,模擬生物體內(nèi)B淋巴細(xì)胞的有關(guān)特性——識別與擴(kuò)增的統(tǒng)一,因而是一種極為高效的表達(dá)和篩選抗體的體系。 噬菌體抗體、多肽庫技術(shù)是以基因工程技術(shù)來生產(chǎn)抗體

5、,它的出現(xiàn)使傳統(tǒng)的以細(xì)胞工程技術(shù)制備單克隆抗體的方法完全改觀,與雜交瘤技術(shù)相比它具有以下的優(yōu)點(diǎn):(1)方法簡單、快速:從淋巴細(xì)胞中提取mRNA到構(gòu)建抗體庫,繼而篩選出目的噬菌體抗體、多肽,整個過程一般只需要幾周的時間,而雜交瘤技術(shù)從脾細(xì)胞融合到獲得穩(wěn)定的單克隆抗體細(xì)胞株至少需數(shù)月。(2)不需要實(shí)驗(yàn)動物或大量的細(xì)胞培養(yǎng)就可生產(chǎn)抗體。(3)可以繞過免疫制備抗體:由于人淋巴細(xì)胞庫中天然存在針對各種抗原的特異性細(xì)胞,可以直接利用人外周血淋巴細(xì)胞

6、構(gòu)建“天然抗體庫”,篩選出目的噬菌體抗體、多肽,使制備全人抗體成為可能,尤其是制備自身抗原和其他弱免疫原性抗原的抗體具有獨(dú)到的優(yōu)勢。(4)可以對抗體基因進(jìn)行改造,在體外通過基因突變、鏈更替等技術(shù),可進(jìn)一步提高抗體的親和力和穩(wěn)定性。(5)可以制備多克隆抗體:對抗體庫進(jìn)行篩庫時,最初得到的是多克隆重組噬菌體抗體、多肽。將該多克隆抗體用于診斷可提高敏感度,用于治療可提高療效,也是分子識別、抗原表位研究的理想工具。(6)可大規(guī)模生產(chǎn),成本低:抗

7、體片段可在大腸桿菌中進(jìn)行分泌型表達(dá),易于分離純化出有生物學(xué)活性的抗體分子,通過發(fā)酵大量生產(chǎn)??朔穗s交瘤細(xì)胞通過單克隆抗體腹水或大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)來制備抗體的局限性。(7)噬菌體抗體、多肽的保存和傳代穩(wěn)定,而雜交瘤細(xì)胞株在傳代過程中則有明顯的不穩(wěn)定性。 噬菌體肽庫技術(shù)實(shí)際上是通過噬菌體展示技術(shù)將一定長度的所有外源多肽展示于噬菌體載體表面,實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)產(chǎn)物與親和篩選相結(jié)合的一種技術(shù)。以噬菌體為載體,把一段特定長度、隨機(jī)合成的基因片段定

8、向插入噬菌體外殼蛋白質(zhì)(如pⅢ和pⅧ)N端的編碼基因中,使這段基因編碼的相應(yīng)外源多肽在噬菌體外殼蛋白的N端以融合蛋白的方式表達(dá)并展示于噬菌體顆粒的表面,而且這種插入的外源多肽不影響和干擾噬菌體的生活周期,同時能夠保持其天然構(gòu)象,可以被相應(yīng)的抗體或受體等靶分子所識別。同時,由于這段特定長度的基因是隨機(jī)合成的,從理論上講這段基因所編碼的相應(yīng)多肽應(yīng)該包含自然界中這個長度肽的所有序列,這樣就構(gòu)成了一個特定長度的多肽庫,而且?guī)烊萘繕O大。進(jìn)而可以利

9、用靶分子,通過適當(dāng)?shù)挠H和富集即生物淘選(biopanning)方法即“親和吸附—洗脫—回收—擴(kuò)增”多輪親和篩選富集過程,洗去未吸附的或非特異結(jié)合的噬菌體,就可以從這個肽庫中篩選到與靶分子特異性結(jié)合、表達(dá)有目的肽的噬菌體,經(jīng)過感染大腸桿菌后可以大量擴(kuò)增。另外,外源多肽展示在噬菌體的表面,但其編碼基因位于病毒單鏈基因中,可通過對噬菌體的DNA測序推導(dǎo)出來,因此這種方式將多肽的表型與基因型密切聯(lián)系在一起,實(shí)現(xiàn)了表型和基因型的轉(zhuǎn)換。 近

10、年來,隨著噬菌體抗體、多肽庫、肽庫技術(shù)的不斷發(fā)展,人們正在廣泛應(yīng)用該技術(shù)研制備種抗體片段。其中,因單鏈抗體具有許多優(yōu)點(diǎn)而成為噬菌體抗體、多肽研究的熱點(diǎn)。單鏈抗體(Single chain variable fragment,ScFv)是由抗體輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)通過一接頭(Linker)連接而組成的,是目前報道最多的一類小分子抗體片段,其分子量僅為完整抗體分子的六分之一,而且還有容易進(jìn)入病灶組織的周圍循環(huán)及在腎內(nèi)清除快等優(yōu)點(diǎn),在疾病的

11、診斷和治療方面已引起廣泛重視。此外,由于單鏈抗體缺少抗體Fc段,只識別靶抗原,不與具有Fc受體的非靶細(xì)胞結(jié)合,因此在體內(nèi)定位診斷時背景低、圖像清晰,在某些疾病的體內(nèi)定位診斷方面也具有無可比擬的優(yōu)點(diǎn)以及巨大的潛在價值。 肺癌是最常見的惡性腫瘤之一,也是致死率最高的惡性腫瘤。歐洲每年新診斷的病例超過20萬,約占所有腫瘤死亡人數(shù)的20%,男性死亡人數(shù)的28%。目前肺癌的主要治療手段是外科手術(shù),進(jìn)展期肺癌手術(shù)后5年生存率不到10%。肺癌

12、總生存率在過去的20年中無明顯提高,約14%。而在過去的30年中,乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等生存率大大提高了,其中一個重要原因是早期診斷。因此,要提高肺癌患者的生存率,早期診斷尤其重要。 目的: 1、通過噬菌體抗體、肽庫技術(shù),以肺癌NCI H1299為抗原篩選并鑒定非小細(xì)胞肺癌特異性結(jié)合多肽。 2、進(jìn)一步利用篩選到的特異性多肽尋找新的非小細(xì)胞肺癌腫瘤標(biāo)志物。 方法: 1、以肺癌細(xì)胞株NCIH129

13、9為抗原,從商業(yè)公司購買經(jīng)過鑒別的噬菌體12多肽庫。 2、將肺癌細(xì)胞貼壁培養(yǎng),利用親和吸附原理,將噬菌體肽庫經(jīng)過4輪的吸附—洗滌—洗脫—富集的淘洗過程,經(jīng)ELISA方法從富集的噬菌體多肽中篩選出特異性的抗肺癌細(xì)胞的噬菌體多肽。 3、將篩選出的結(jié)合肺癌的噬菌體多肽克隆,提取、純化噬菌體質(zhì)粒,DNA測序,合成多肽,標(biāo)記熒光素,以ELISA和免疫組織化學(xué)方法對肺癌細(xì)胞和MRC—5正常肺細(xì)胞進(jìn)行初步特異性結(jié)合鑒定。 4、

14、肺癌特異性結(jié)合多肽競爭性抑制試驗(yàn),將為標(biāo)記的合成多肽與噬菌體競爭抑制,計算噬菌體克隆,確定其特異性。 5、以特異性結(jié)合多肽為探針篩選人肺癌cDNA文庫,“釣取”肺癌特異性抗原——肺癌腫瘤新標(biāo)志物。 結(jié)果: 1、以肺癌NCI H1299為抗原,從構(gòu)建好的噬菌體多肽庫進(jìn)行4輪“吸附—洗滌—洗脫—擴(kuò)增”的淘洗,挑選出9個經(jīng)ELISA方法鑒定的特異性肺癌結(jié)合陽性的噬菌體多肽克隆。 2、全部提取噬菌體質(zhì)粒、測序,結(jié)

15、果表明,我們獲得了9個特異性結(jié)合多肽,并且其中一個多肽的親和力最高(ZP1),其氨基酸序列為HNKHLPSTQPLA(已經(jīng)申請專利、受理中),通過化學(xué)方法合成該多肽,其中一部分標(biāo)記熒光素FITC。 3、利用熒光標(biāo)記多肽,經(jīng)細(xì)胞熒光和免疫化學(xué)證實(shí),ZP1的特異性和親和力較高,為肺癌特異性最強(qiáng)結(jié)合多肽。 4、ZP1多肽與含ZP1多肽的噬菌體競爭性抑制試驗(yàn),表明ZP1具有較強(qiáng)的親和力和特異性,這說明我們篩選到的ZP1是特異性地

16、結(jié)合在肺癌細(xì)胞上的。 5、以特異性結(jié)合多肽ZP1標(biāo)記熒光素FITC為探針篩選人肺癌cDNA文庫,“釣取”肺癌特異性抗原——肺癌腫瘤新標(biāo)志物,我們成功獲得了細(xì)胞膜蛋白——periplakin。 結(jié)論: 1、以NCI H1299為抗原,從噬菌體12多肽庫中成功篩選出結(jié)合肺癌特異性抗原的特異性噬菌體克隆9個,并成功地鑒別其結(jié)合肺癌抗原的特異性。 2、發(fā)現(xiàn)了ZP1序列為一全新的多肽,利用體內(nèi)外特異性噬菌體克?。ê?/p>

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