人HRP-2分子的二聚體生物學(xué)特性和sumo化修飾篩選基因.pdf

1、肝癌衍生生長(zhǎng)因子HDGF(Hepatoma-derivedgrowthfactor)最初是從無血清培養(yǎng)人類肝癌細(xì)胞株HUH-7中純化得到的高肝素親和性生長(zhǎng)因子，具有促成纖維細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，血管平滑肌細(xì)胞和一些肝癌細(xì)胞等多種細(xì)胞生長(zhǎng)的功能。其家族成員包括HDGF和其相關(guān)蛋白HRPs以及LEDGF，其共同的結(jié)構(gòu)特征是N端有一高度保守的HATH區(qū)，N端無類似信號(hào)肽的疏水區(qū)，具有二分的NLS。 ffRP-2基因是最新發(fā)現(xiàn)的HDGF相關(guān)蛋

2、白家族的一個(gè)重要成員，定位于19p13．3區(qū)帶，由12個(gè)外顯子組成，其cDNA全長(zhǎng)2344bp，編碼671個(gè)氨基酸。HRP-2與HDGF的同源性為12．7％。其N端也有一個(gè)高度保守的HATH(PWWP)結(jié)構(gòu)域。 HDGF家族的HATH區(qū)同源性很高，高同源性提示HATH是維持HDGF家族分子功能的重要功能域。HATH區(qū)也有類似的核定位信號(hào)。業(yè)已證實(shí)，轉(zhuǎn)錄協(xié)同因子P52／P75中N端也有和HDGF的HATH同源度達(dá)71％的區(qū)域。P5

3、2／P75通過介導(dǎo)上游特異序列激活子和轉(zhuǎn)錄復(fù)合物結(jié)合從而影響轉(zhuǎn)錄。因此推測(cè)HATH區(qū)也有部分定位到細(xì)胞核的作用。此外，HATH區(qū)可能與肝素的結(jié)合有關(guān)?，F(xiàn)有研究表明，突變或缺失HATH區(qū)的外源性HDGF蛋白不能進(jìn)入細(xì)胞。這提示HATH區(qū)可能在HDGF家族靶向到細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。Hepatoma—derivedgrowthfactorrelatedproteinII(HRP-2)是HDGFs家族一個(gè)重要成員，其N端也有一個(gè)HATH結(jié)構(gòu)域。

4、 本研究通過體外表達(dá)HATH(PWWP)融合蛋白，再過分子篩時(shí)發(fā)現(xiàn)有雙峰的特性，經(jīng)分析顯示分子量約為單體和二聚體，由此提示該分子有單體和二聚體兩種形式。繼而非變性膠實(shí)驗(yàn)也證實(shí)這一點(diǎn)。為排除融合蛋白GST本身形成二聚體，采用全長(zhǎng)hrp-2／myc和hrp-2A／myc(HATH)，B／myc(中斷)，C／myc片斷(尾巴)與GST-HATH(PWWP)作PULL-DOWN分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明人HRP-2的HATH(PWWP)結(jié)構(gòu)域能

5、形成二聚。正如P53等很多蛋白必須形成多聚體結(jié)構(gòu)才有活性，HRP-2可能通過HATH結(jié)構(gòu)域形成二聚體產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)活性，但確切機(jī)制及相應(yīng)功能還有待進(jìn)一步的研究。 此外我們還建立了體內(nèi)小泛素化樣修飾(SUMO)系統(tǒng)。細(xì)胞生命活動(dòng)的調(diào)控在分子水平表現(xiàn)為蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)的相互作用協(xié)調(diào)性。此協(xié)調(diào)性可通過可逆性蛋白質(zhì)共價(jià)修飾來進(jìn)行。SUMO(Smailubiquitin-1ikemodifier)是近年來發(fā)現(xiàn)的在結(jié)構(gòu)上類似于泛素的一類小分

6、子蛋白質(zhì)修飾物，SUMO通過與靶蛋白共價(jià)結(jié)合修飾廣泛參與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄、核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)與定位、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和維持基因組穩(wěn)定等功能。目前己發(fā)現(xiàn)有4種SUMO家族蛋白(SUMO-1，-2，-3andsumo-4)和至少50種SUMO修飾的底物被鑒定。SUMO的研究涉及到多種重要的功能包括：信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)錄，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，DNA損傷修復(fù)和染色體分離。其中蛋白激酶的SUMO化修飾對(duì)其正確的細(xì)胞內(nèi)定位及功能是至關(guān)重要的。我們通過SUMOplot分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)室40