HGF基因修飾的MSC生物學(xué)特性及免疫調(diào)控作用研究.pdf

1、間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)可通過細(xì)胞間作用及分泌細(xì)胞因子(HGF、TGF-p等)抑制淋巴細(xì)胞增殖，與造血干細(xì)胞共移植能夠減低GVHD的發(fā)生。肝細(xì)胞生長因子(HGF)在小鼠異基因骨髓移植模型中具有免疫抑制和修復(fù)損傷作用，從多環(huán)節(jié)減輕GVHD的發(fā)生，同時保留GVL效應(yīng)。為明確MSC和HGF基因兩者聯(lián)合是否具有免疫協(xié)同效應(yīng)，開展了HGF基因修飾MSC免疫調(diào)控作用的研究。期望為HGF基因修飾骨髓問充質(zhì)干細(xì)胞防治GVHD提供實驗基礎(chǔ)。 利用P

2、ercoll密度梯度離心與貼壁培養(yǎng)擴(kuò)增人骨髓來源的MSC，利用酶消化后骨片培養(yǎng)的方法分離純化小鼠骨來源的MSC。上述細(xì)胞均呈貼壁生長的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，表型特征分析顯示細(xì)胞為非造血非內(nèi)皮細(xì)胞群，分化試驗證明細(xì)胞具有體外成骨和成脂肪能力，說明獲得的細(xì)胞符合MSC的確認(rèn)“標(biāo)準(zhǔn)”。在此基礎(chǔ)上，觀察了HGF基因轉(zhuǎn)染對MSC生物學(xué)特性的影響。首先，利用攜帶GFP基因的腺病毒載體(Ad-GFP)感染MSC，以GFP為報告基因，確定了重組腺病毒對MS

3、C的感染效率。流式檢測結(jié)果表明，腺病毒感染強(qiáng)度MOI為150時，感染效率幾乎達(dá)到了100％；利用相同MOI的Ad-HGF感染MSC，用ELISA法檢測HGF的分泌表達(dá)，結(jié)果表明感染后HGF可在短期內(nèi)高效表達(dá)。提示腺病毒可以有效介導(dǎo)HGF在MSC中表達(dá)。 為確定HGF基因轉(zhuǎn)染對MSC生物學(xué)特性的影響，檢測了轉(zhuǎn)HGF基因MSC(MSC-HGF)的細(xì)胞表型，結(jié)果表明轉(zhuǎn)HGF基因不影響MSC表型，與未轉(zhuǎn)染基因細(xì)胞相似，MSC-HGF仍表

4、達(dá)CD29、CD73、CDl05、CDl66和HLA-ABC，不表達(dá)CD31、CD34、CD45以及HLA-DR。進(jìn)一步檢測了MSC-HGF的分化性能，誘導(dǎo)脂肪分化后油紅O染色顯示MSC-HGF體外成脂肪能力正常；誘導(dǎo)成骨分化后進(jìn)行ALP活性染色和定量以及Ca沉積定量均表明MSC-HGF仍具有體外成骨能力；用地塞米松誘導(dǎo)后，在mRNA水平檢測到成骨、脂肪和軟骨分化相關(guān)基因的表達(dá)；另外，不誘導(dǎo)時MSC-HGF與MSC成骨、成軟骨和成脂肪標(biāo)

5、志分子表達(dá)無差異，說明HGF基因修飾本身不引起間充質(zhì)干細(xì)胞分化，并且不影響MS體外多向分化潛能，從以上兩方面可以認(rèn)定HGF基因修飾不改變MSC固有特性。 MSC表達(dá)HGF受體c-Met。研究表明重組HGF可以明顯誘導(dǎo)MSC的遷移，而且存在劑量依賴關(guān)系。應(yīng)用低血清饑餓的細(xì)胞損傷模型，我們觀察到MSC-HGF進(jìn)入S期的細(xì)胞百分比明顯高于對照組，說明HGF基因轉(zhuǎn)染增強(qiáng)MSC在低血清環(huán)境中的存活能力，表明MSC-HGF自分泌HGF有可能

6、調(diào)節(jié)MSC的歸巢和存活。 進(jìn)一步觀察了MSC-HGF在體內(nèi)外的免疫調(diào)節(jié)作用。在體外混合淋巴反應(yīng)中，MSC-HGF可顯著抑制由異基因淋巴細(xì)胞或有絲分裂原刺激引起的淋巴細(xì)胞增殖，并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，與MSC組間差異有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義，說明HGF基因修飾顯著增強(qiáng)MSC體外免疫抑制功能。在此基礎(chǔ)上，按5×105cells／只將雌性C57BL／6J的MSC-HGF(或者M(jìn)SC)由尾靜脈輸注至BALB／c受體小鼠體內(nèi)，之后建立異基因小鼠(C

7、57BL／6-*BALB／c)皮膚移植模型，以評價MSC-HGF體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果證實：與MSC組比較，MSC-HGF輸注可以明顯延長小鼠異基因皮膚移植物存活時間；組織病理分析也提示MSC-HGF減輕了異基因免疫反應(yīng)引起的病理變化，對組織有一定的保護(hù)作用，上述結(jié)果表明MSC-HGF可抑制體內(nèi)正在進(jìn)行的免疫反應(yīng)過程，從而促進(jìn)移植皮膚存活和減輕病理損害。通過以上結(jié)果，可以得出：1)HGF基因轉(zhuǎn)染MSC后不改變其表型特征和功能特性；2)H