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文檔簡介
1、HMGBl可促進多種細胞的增殖、遷移、分化以及細胞骨架重建和傷口愈合,因此被歸為一類新的具有細胞趨化作用的組織修復信號分子。人體內的MSC是無組織特異性的組織修復啟動細胞,多種趨化因子和組織損傷信號分子可以動員MSC,并在特定條件下誘導其分化為構成結締組織的細胞。推測HMGBl很可能會影響MSC的遷移、增殖和分化等生物學特性。因此,本研究觀察了HMGBl對MSC表型、增殖、遷移,以及向成骨、成軟骨和成脂肪分化性能的影響及其相關機制。
2、 通過RT-PCR方法擴增出人HMGBl的全長編碼基因,克隆于原核表達載體pET-24a-d(+),從而構建了HMGBl的原核表達載體;經(jīng)IPTG誘導表達,通過親和層析方法純化得到了HMGBl融合蛋白。該蛋白在體外能夠誘導大鼠血管平滑肌細胞的遷移,證明具有生物學活性。從人骨髓中分離并培養(yǎng)了MSC,鑒定了其免疫表型和多向分化潛能。RT-PCR方法證實MSC表達HMGBl的受體RAGE和TLR-4。在此基礎上較系統(tǒng)研究了HMGBl對MS
3、C生物學特性的影響。 1.HMGBl對MSC免疫表型的影響。25ng/ml的HMGBl作用2周后,MSC的免疫表型CD29、CDl66、CD73、HLA-DR、CD80和CD86的表達均未發(fā)生明顯變化,提示此濃度的HMGBl不影響其免疫表型。 2.HMGBl對MSC向成骨細胞分化特性的影響。HMGBl可提高MSC的ALP活性,且上調向成骨細胞分化的標志基因和轉錄因子(OPN、OCN、ALP、runx2)的表達。但并不能體
4、外誘導MSC形成骨結節(jié)以及隨后的礦化。因此,HMGBl雖然能促進骨髓MSC向成骨細胞分化,但不能誘導MSC分化為成熟的骨細胞。為了探索HMGBl影響MSC向骨系列分化的機制,用中和性抗RAGE抗體阻斷MSC表面的RAGE后檢測了MSC向成骨分化過程中標志基因的表達。結果顯示,OPN和ALP在RNA水平無明顯變化;vonKossa染色結果表明,僅加HMGBl的培養(yǎng)孔內無骨基質沉積,但是另外加有抗RAGE抗體的則有骨基質沉積,即阻斷RAGE
5、抑制了HMGBl對MSC向成骨細胞分化的作用。因此,HMGBl誘導MSC向成骨細胞分化的過程依賴于與RAGE結合。 3.HMGBl對MSC向軟骨和脂肪細胞分化的作用。HMGBl作用后第3天MSC即表達X型膠原和分化特異性轉錄因子sox5、sox6和sox9,提示HMGBl可促進MSC向軟骨系列分化。但封閉RAGE后,X型膠原和sox5并無明顯變化,提示此作用不依賴RAGE受體。此外,雖然HMGBl可誘導MSC形成極少數(shù)的脂肪小泡
6、,但并沒有典型的脂肪細胞形成,且不能上調脂肪細胞分化標志基因PPAR72的表達,因此HMGBl不能誘導MSC向脂肪細胞分化。 4.HMGBl促進MSC的增殖和遷移。HMGBl可促進MSC的增殖并且具有較明顯的促進MSC遷移的作用。為了探討HMGBl促進MSC遷移的機制,研究了HMGBl與SPK-S1P-EDG細胞信號通路的關系,表明:(1)MSC表達S1P的特定受體EDGl、3和5;(2)HMGBl能明顯增強SPK的活性,并且呈
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