轉(zhuǎn)重組人IL-1Ra和TGF-β1基因治療兔骨性關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究的目的:是評(píng)估通過(guò)在脂質(zhì)體介導(dǎo)下聯(lián)合應(yīng)用IL-1Ra和TGF-β1基因防止關(guān)節(jié)軟骨退變的能力。我們假設(shè)聯(lián)合應(yīng)用抑制性細(xì)胞因子和促合成代謝因子能夠防止軟骨退變和促進(jìn)軟骨基質(zhì)的合成。 第一部分重組人IL-1Ra和TGF-β1質(zhì)粒的構(gòu)建 目的：擴(kuò)增、純化重組人基因pEGFP-C1-IL-1Ra和pEGFP-C1-TGF-β1，并進(jìn)行酶切鑒定，為基因轉(zhuǎn)染提供目的基因。 方法：從人胎肝細(xì)胞中提取總RNA，RT-PCR

2、法逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板，PCR擴(kuò)增IL-1Ra和TGF-β1目的基因片段，克隆進(jìn)pGEM-T Easy Vector載體并測(cè)序。通過(guò)Bgl II和XhoI進(jìn)行雙酶切，酶切片斷通過(guò)T4DNA連接酶連接到pEGFP-C1載體上，構(gòu)建pEGFP-C1-IL-1Ra和pEGFP-C1-TGF-β1表達(dá)質(zhì)粒。制備DH5a感受態(tài)，進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，鋪板篩選并提取陽(yáng)性克隆酶切鑒定。 結(jié)論：成功克隆和建立重組人pEGFP-C1-I

3、L-1RαpEGFP-C1-TGF-β1真核表達(dá)質(zhì)粒，為進(jìn)一步OA基因治療研究奠定了基礎(chǔ)。 第二部分重組人IL-1Ra和TGF-β1基因轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞后的表達(dá) 目的：探討重組人IL-1Ra和TGF-β1雙基因轉(zhuǎn)染兔軟骨細(xì)胞后的表達(dá)及對(duì)細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響，為OA基因治療中目的基因的選擇提供參考。 方法：無(wú)菌條件下取新西蘭白兔髖膝關(guān)節(jié)軟骨，經(jīng)消化分離，軟骨細(xì)胞以1.5×105／ml濃度培養(yǎng)于6孔培養(yǎng)板。軟骨細(xì)胞分為4

4、組，即轉(zhuǎn)染IL-1Ra(4μg)組、轉(zhuǎn)染TGF-β1(4μg)組、轉(zhuǎn)染IL-1Ra(4μg)+TGF-βl(4μg)雙基因組、未轉(zhuǎn)染組。上述轉(zhuǎn)染組均以Lipofectamine TM 2000 Reagent脂質(zhì)體為轉(zhuǎn)染媒介。通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)其表達(dá)，MTT法檢測(cè)IL-1Ra和TGF-v1基因轉(zhuǎn)染對(duì)軟骨細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響。 結(jié)論：IL-1Ra和TGF-β1雙基因轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞可以獲得表達(dá)，

5、為OA的基因治療提供研究基礎(chǔ)。 第三部分轉(zhuǎn)IL-1Ra和TGF-β1基因治療兔骨性關(guān)節(jié)炎的體外實(shí)驗(yàn) 研究目的：觀察重組人IL-1Ra和TGF-β1雙基因在體外對(duì)兔OA軟骨退變的治療效果，為今后OA的基因治療提供依據(jù)。 方法：取新西蘭白兔關(guān)節(jié)軟骨，經(jīng)消化分離，軟骨細(xì)胞以1.5×105／ml濃度培養(yǎng)于6孔培養(yǎng)板。軟骨細(xì)胞分為5組，轉(zhuǎn)染IL-1Ra組、轉(zhuǎn)染TGF-β1組、轉(zhuǎn)染IL-1Ra+TGF-β1雙基因組、未轉(zhuǎn)染組

6、、空白組，轉(zhuǎn)染方法同第二部分。上述轉(zhuǎn)染組均以Lipofectamine TM 2000 Reagent脂質(zhì)體為轉(zhuǎn)染媒介。各組加入軟骨塊，除空白組外，其余各組均加入20ng IL-1β，通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。分別于2d、4d、6d后每組各取4孔1.5ml培養(yǎng)基，ELISA法檢測(cè)TGF-β1和IL-1Ra的含量，RIA法檢測(cè)IL-1β和TNF-α的含量。收集第6d軟骨塊HE染色、阿爾新藍(lán)染色及II型膠原免疫組化檢測(cè)等組織學(xué)觀察

7、。 結(jié)論：轉(zhuǎn)基因組均對(duì)損傷軟骨有修復(fù)作用。轉(zhuǎn)染IL-1Ra+TGF-β1雙基因組的治療效果優(yōu)于單基因。聯(lián)合應(yīng)用IL-1Ra和TGF-β1能抑制軟骨的退變和促進(jìn)軟骨的修復(fù)，為體外OA的基因治療提供良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第四部分轉(zhuǎn)IL-1Ra和TGF-β1基因治療兔骨性關(guān)節(jié)炎的體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 研究目的：觀察重組人IL-1Ra和TGF-β1雙基因在兔體內(nèi)對(duì)OA軟骨退變的治療效果，為今后OA的基因治療提供依據(jù)。 方法：采用

8、切斷并切除內(nèi)側(cè)副韌帶0.5cm及切除內(nèi)側(cè)半月板的方法，將16只新西蘭白兔的雙膝關(guān)節(jié)制成早期OA模型，術(shù)后第5d，分為4組向關(guān)節(jié)腔注射，A：空白對(duì)照組(NS 0.5ml)，B：IL-1Ra 100μg+脂質(zhì)體50μl+NS 0.5ml，C：TGF-β100μg+脂質(zhì)體50μl+NS 0.5ml，D：IL-1Ra100μg+TGF-β1100μg+脂質(zhì)體100μl+NS 1ml。兩天后再注射一次。注射后第7d用無(wú)菌NS灌沈關(guān)節(jié)腔，抽取關(guān)節(jié)灌