水稻AP2-EREBP轉錄因子基因OsDRE和OsRAF的功能分析.pdf

1、AP2是一個大的轉錄因子家族，因其成員含有一個60-70個氨基酸殘基的保守結構域即AP2結構域而得名，它們的功能涉及植物花的發(fā)育以及植物對生物或非生物逆境的應答反應。根據它們所含的AP2結構域的數目，這個家族可分為AP2亞家族和EREBP亞家族。AP2亞家族成員含兩個AP2結構域，EREBP亞家族成員含一個AP2結構域。一般來說，AP2亞家族的成員主要參與植物發(fā)育過程的調控；EREBP亞家族成員則主要參與對逆境的應答反應。按照它們響應外

2、界刺激的類型和AP2結構域中結合順式作用元件的核心氨基酸的不同，EREBP亞家族又可分為ERF和CBF/DREB兩大類群，ERF類主要響應生物類逆境的誘導，CBF/DREB類則響應干旱、低溫等非生物脅迫的刺激。
　　 根據AP2保守結構域搜索，水稻基因組中一共有147個AP2/EREBP成員，但其中功能得到證實的還非常有限。為了解更多AP2基因在植物生長發(fā)育過程中的功能，我們先從水稻基因組數據庫中搜索到含有AP2/EREBP結構

3、域的推測基因序列，選擇其中40個擴增并成功擴增出31個，將這些DNA片段點在尼龍膜上，然后用水稻葉片cDNA作模板標記探針，與固定在膜上的推測基因雜交。雜交結果作為選擇基因進行功能分析的重要依據。
　　 OsDRE就是我們選擇進行研究的一個表達較強的基因。首先，通過RACE克隆得到OsDRE的cDNA全長1589bp，它編碼318個氨基酸。Blast搜索和保守結構域序列比對分析以及進化樹分析顯示它是一個新的ERF基因。RT-PC

4、R分析表明該基因在水稻各種組織中表達量比較一致，而且，OsDRE既不對植物生長物質如乙烯，水楊酸(SA)，茉莉酸甲酯(MJ)，脫落酸(ABA)，赤霉素(GA3)，油菜素內酯(BR)的誘導起反應，同樣也不響應環(huán)境因子如低溫、干旱條件的處理。這些結果說明OsDRE是一個不響應脅迫相關因素的誘導的、組成型表達的水稻基因。用OsDRE的非保守區(qū)域構建的RNAi載體轉入水稻后未能使轉基因水稻產生異常表型，然而，OsDRE在水稻和擬南芥中的過量表達

5、都導致轉基因植物出現植株矮小、開花延遲、生長周期延長以及育性降低等表型，說明OsDRE對生長和發(fā)育的影響在水稻和擬南芥中是一致的。
　　 基于以上原因，我們選擇在遺傳分析方面有明顯優(yōu)勢的擬南芥作為材料，對OsDRE基因功能進行研究并得出以下結論：
　　 (1)瞬時表達和隨后的過量表達證明OsDRE定位于細胞核中，過量表達OsDRE引起轉基因植株的生長周期變長、抽苔時間延遲和抽苔時蓮座葉的數量增多；
　　 (2)過

6、量表達OsDRE通過一種不影響細胞數量的方式抑制了細胞的膨脹從而導致植物器官以致整個植株變小，而且，在此過程中部分器官的形態(tài)也受到了影響；
　　 (3)OsDRE過量表達能激活已知位于乙烯信號途徑下游的基因表達并且轉基因植株幼苗在黑暗中出現下胚軸及根縮短變粗的現象，提示OsDRE可能部分參與了乙烯信號途徑下游的反應。
　　 除此之外，我們還初步分析了另一個EREBP基因，并將其命名為OsRAF。氨基酸序列分析表明該基因與

7、大麥的RAF基因在蛋白水平上相似性最高。Northern雜交結果進一步顯示，與RAF一樣，OsRAF也是根中優(yōu)勢表達的基因，并且它的表達量在乙烯或低溫的誘導下增加。對轉基因植株的觀察和瞬時表達表明OsRAF定位于細胞核中。
　　 綜上所述，對水稻基因OsDRE和OsRAF的分析表明，OsDRE是一個新的ERF基因，它不受乙烯等因素的誘導并且過量表達該基因導致轉基因植株出現細胞膨脹受到抑制等一系列的表型。另外，OsRAF在水稻根中