海產品中副溶血性弧菌有機酸—溫度協(xié)同控制及其酸耐受調控因子的表達規(guī)律研究.pdf

1、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，Vp)是海產品引發(fā)食源性胃腸疾病的主要病原菌。隨著水產品流通的加快，Vp引發(fā)中毒的食物不僅僅集中于海產品，由海產品加工不當和交叉污染引起的Vp食源性疾病流行已呈上升趨勢，因此控制海產品中Vp的攜帶量顯得尤為重要。目前，海產品中Vp減除措施主要有暫養(yǎng)和凈化、溫度處理、高壓處理、輻射等，但是這些方法很難兼顧到除菌效果和海產品原有風味的維持。近年來有許多學者提出有機酸可以用于食物保

2、鮮和儲藏，因此有機酸和其它減菌方法的聯(lián)合使用已成為控制食物中細菌載量的研究熱點。
　　細菌酸耐受細胞的形成是弱酸減菌化處理中的關鍵技術問題，但目前對Vp在弱酸性條件下的耐受機制尚不清楚。本文通過研究檸檬酸和溫度對海產品中Vp的協(xié)同抑制作用，建立了海產品中Vp減菌化處理方法。該方法不僅有效降低了Vp的攜帶量，還保持了海產品的鮮度。同時研究了Vp在弱酸性條件下產生的酸耐受誘導反應，并探討了Vp的酸耐受調控因子表達規(guī)律，為建立海產品中V

3、p的高效減菌技術提供了理論依據(jù)。
　　1.有機酸和溫度對海產品中副溶血性弧菌的減菌效應
　　采用響應曲面分析法對Vp的減菌條件進行優(yōu)化。對Vp死亡率影響因素進行單因素分析后，以Box-Benhnken設計(BBD)評價溫度、時間、pH三個因素顯著性和交互作用，得出Vp最佳減除條件為:溫度55.5℃、時間25s、pH4.96。在該條件下，Vp死亡率的預測值為97.36％，在三文魚模擬污染樣品中驗證該值達97.07％，并且該條件

4、處理前后魚肌原纖維蛋白的Ca2+-ATPase活性沒有顯著差異。
　　2.副溶血性弧菌酸耐受誘導及其δ因子表達規(guī)律
　　本研究選取6株不同來源Vp，將其分別在pH5.5和pH7.5環(huán)境中適應1h，再在pH4.0環(huán)境中脅迫1h，測定存活率。并在該條件下，采用相對定量法檢測cadA、toxR基因以及10種潛在的δ因子的表達水平。結果發(fā)現(xiàn)菌株RIMD2210663和VP098經pH5.5環(huán)境適應的存活率比經pH7.5環(huán)境適應的存活

5、率高，產生了酸耐受反應;菌株ATCC33847檢測不到存活細胞，其它菌株雖有存活，但經pH5.5環(huán)境適應的存活率比經pH7.5環(huán)境適應的存活率低，沒有產生酸耐受反應;cadA、VPA1690、VP2358基因在6種菌株中的表達均上調，VP2553、VPA1555、VP2210、VP2953基因表達上調的菌株能檢測到存活細菌，toxR基因表達上調的菌株產生了酸耐受反應。
　　大流行株RIMD2210663在不同pH適應處理1h后，再

6、在pH4.0環(huán)境中脅迫1h后，測定其存活率，并檢測cadA、toxR以及10種潛在的δ因子的表達水平，分析RIMD2210663在酸脅迫下相關基因的表達與適應pH和存活率的關系。結果表明所選目的基因都是低pH誘導表達的基因，其中cadA、VP2358、VP2578的表達受環(huán)境pH影響顯著高于其它基因;cadA、toxR、VP0055、VPA1555、VPA1690、VP2232、VP2578、VP2670、VP2953基因在存活率達到2

7、.91％時表達量最高;VP2358基因在存活率達到17.7％時表達量最高;VP2553的表達量隨存活率的增加緩慢上升。不同pH適應條件對cadA、toxR以及δ因子誘導表達具有顯著影響。雖然pH4.5和pH6.0適應條件都可以誘導酸耐受相關基因的表達，并且pH4.5誘導表達水平較高，但是它們都不能誘導菌株產生酸耐受反應。其主要原因是pH4.5適應階段大部分Vp已經死亡;Vp雖然能在pH6.0適應階段存活，但是酸耐受相關基因未被有效誘導表

8、達，使細胞酸耐受能力不強，無法抵抗致死酸環(huán)境。
　　3.VP2358在副溶血性弧菌酸耐受中的作用
　　以RIMD2210663基因組為模板，PCR擴增VP2358上下游DNA序列，并以其為模板，通過重疊PCR獲得VP2358上下游序列拼接片段。將拼接片段克隆入pMD20-T載體，成功構建重組質粒pMD-⊿VP2358。通過PstI單酶切，回收pMD-⊿VP2358中的VP2358上下游拼接片段，并將其與自殺質粒pDS132連

9、接，連接產物轉入s17感受態(tài)細胞，獲得重組質粒pDS132-⊿VP2358。通過第一輪重組，篩選出含有pDS132-⊿VP2358質粒的RIMD2210663。將其通過第二輪重組，用氯霉素抗性LC平板反向篩選，結合靶基因內外引物PCR鑒定，成功構建出缺失株RIMD2210663⊿VP2358。
　　將突變株RIMD2210663⊿VP2358及其野生株在pH4.5、pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH7.5，37℃環(huán)境中分別適

10、應1h后，再在pH4.0，37℃環(huán)境中脅迫處理1h，測定存活率。結果表明，突變株經不同pH環(huán)境適應后，其對致死酸環(huán)境的抵抗力低于野生株。進一步研究顯示，在酸適應過程中VP2358的缺失對δ因子和酸耐受基因的表達水平也產生了影響。將突變株和野生株在pH5.5環(huán)境中適應1h，再在pH4.0環(huán)境中脅迫1h后，以野生株為對照，檢測突變株cadA、rpoS、toxR基因的相對表達水平。結果表明突變株cadA、rpoS、toxR基因的表達量分別是野