HPV主要衣殼蛋白L1基因原核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及尖銳濕疣組織標(biāo)本中HPV-6-11型感染率和L1基因表達(dá)率的研究.pdf

1、人乳頭瘤病毒(HumanPapillomavirus，HPV)是雙鏈DNA病毒，有嚴(yán)格的嗜上皮性。由于基因組序列差異，目前發(fā)現(xiàn)HPV有130余基因型。HPV的L1和L2基因分別編碼主要衣殼蛋白L1和次要衣殼蛋白L2，兩者組成病毒的蛋白衣殼，其中L1蛋白和L3蛋白組成比例為25～30：1。L1基因全長1.5kb，其表達(dá)產(chǎn)物分子量為55～60KD。L1蛋白序列相當(dāng)保守，是HPV主要種屬特異性抗原，可誘生中和性抗體。 HPV主要感染人

2、類的皮膚和粘膜組織，引起上皮組織增生性疾病。按照HPV不同型別感染后的危害程度，流行病學(xué)上將其分為高危、中等及低危三種類型。高危型如HPV-16、HPV-18和HPV-45型等，中間型包括HPV-33、HPV-35和HPV-58型等，高危型和中間型HPV與宮頸癌(cervicalcarcinoma)發(fā)生密切相關(guān)。低危型如HPV-6、HPV-11、HPV-42、HPV-43和HPV-44型等，常導(dǎo)致皮膚尋常疣和生殖器的尖銳濕疣(point

3、edcondyloma)，其中以HPV-6和HPV-11引起尖銳濕疣最為常見。 由于宮頸癌是最為常見的婦科惡性腫瘤，尖銳濕疣是主要性傳播性疾病之一，因而HPV疫苗是近年相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。有文獻(xiàn)報道，L1基因表達(dá)產(chǎn)物或L1和L2共同表達(dá)后組成的病毒樣顆粒(viruslike-particles，VLPs)，均能誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動物產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答，但VLPs產(chǎn)量均較低。目前，針對宮頸癌基于HPVL1蛋白的VLP疫苗己進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)，

4、其實(shí)際預(yù)防效果尚無定論。 目前對HPV感染的實(shí)驗(yàn)室診斷，主要依賴于PCR、Southern雜交等分子生物學(xué)技術(shù)檢測HPV特異性基因片段。然而，這些方法無法了解患者有無對HPV的免疫應(yīng)答及其狀態(tài)，有一定比列的假陽性，且費(fèi)用高昂。眾所周知，血清學(xué)技術(shù)也是檢測特定病原體感染的主要手段之一。但目前HPV尚無可靠的體外培養(yǎng)方法，也不能在動物體內(nèi)增殖，因而難以獲得血清學(xué)檢查所需的HPV抗原。因此，采用基因工程技術(shù)，構(gòu)建HPV主要衣殼蛋白L1

5、基因高效表達(dá)系統(tǒng)，從而較為便利地獲得大量目的重組表達(dá)產(chǎn)物。利用重組主要衣殼蛋白L1(recombinantL1，rL1)所建立的相關(guān)血清學(xué)檢測方法，不僅可用于尖銳濕疣的臨床實(shí)驗(yàn)室診斷，也可作為HPV感染和宮頸癌及其癌前病變血清流行病學(xué)調(diào)查的重要手段。然而，目前尚無文獻(xiàn)報道HPV相關(guān)疾病的血清學(xué)檢測方法。 本研究建立了基于L1基因的可同時檢測HPV-6和HPV-11的雙重PCR，以了解我國尖銳濕疣患者組織標(biāo)本中HPV-6和HPV-

6、11感染率的差異；從尖銳濕疣患者病變組織中克隆了HPV-6的全長L1基因并構(gòu)建了其高效原核表達(dá)系統(tǒng)，建立了ELISA檢測標(biāo)本中HPVL1基因表達(dá)情況，為rL1作為實(shí)驗(yàn)室診斷乃至疫苗的候選抗原提供依據(jù)。 材料和方法 1.DNA模板的制備： 尖銳濕疣組織標(biāo)本充分剪切研磨后，部分用于L1蛋白的ELISA測定，其余用上海博彩生物科技有限公司(Biocolor)GenomicDNAPurificationKit提取DNA，

7、并用紫外分光光度法測定DNA濃度和純度。 2.目的基因的擴(kuò)增： 根據(jù)報道的HPV-6型L1基因(GenbankNo.：NC001668、AF067036、AF092932)的核苷酸序列和內(nèi)切酶圖譜分析結(jié)果，設(shè)計(jì)含合適內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物。采用PCR擴(kuò)增尖銳濕疣組織標(biāo)本中的目的基因，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。 3.T-A克隆、測序與表達(dá)載體的構(gòu)建： 采用上海博亞生物科技有限公司(BioAsia)的T-A克隆試

8、劑盒將擴(kuò)增的目的片段克隆至pGEM-T載體中，轉(zhuǎn)化于E.coliDH5α株并增菌，堿變性法提取重組質(zhì)粒。獲得滿意的測序結(jié)果后，分別將含pGEM-T-L1和pET32a的E.coliDH5α菌株增菌，提取質(zhì)粒后用雙酶切獲得的目的基因片段與線性pET32a，兩者連接后轉(zhuǎn)化于E.coliBL21DE3，增菌、提取重組質(zhì)粒后再次測序，并與上述報道的HPV-6型L1基因序列進(jìn)行同源性比較。 4.目的重組蛋白表達(dá)與純化： L1基因原

9、核表達(dá)系統(tǒng)pET32a-L1-E.coliBL21DE3用不同濃度IPTG37℃誘導(dǎo)表達(dá)4h，用10％SDS-PAGE檢查目的重組蛋白rL1的表達(dá)情況。采用Ni-NTA(BioAsia)親和層析法收集表達(dá)的rL1。 5.rL1抗血清制備及其效價測定 常規(guī)家兔皮下免疫法制備rL1抗血清，采用免疫雙擴(kuò)散試驗(yàn)確定rL1抗血清的效價。 6.臨床標(biāo)本中L1基因表達(dá)情況的檢測 116例患者尖銳濕疣組織標(biāo)本勻漿后超聲破

10、碎(300V,5S×3)，3000r/min離心10min后取上清，用紫外分光光度法測定其蛋白濃度。用蛋白含量為100μg/ml的尖銳濕疣組織超聲破碎物上清為包被抗原，1∶500稀釋的兔抗L1血清為一抗、1∶3000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(JacksonImmunoResearch)為二抗，建立ELISA檢測上述尖銳濕疣組織標(biāo)本中L1蛋白。實(shí)驗(yàn)中同時用5份相同蛋白含量的手術(shù)切除包皮超聲破碎物上清和rL1分別為陰性和陽性對照。以O(shè)P

11、T為底物，用酶聯(lián)免疫檢測儀測定各標(biāo)本的OD490值，以5份陰性對照OD490均值加3SD為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)。 7.尖銳濕疵標(biāo)本中HPV-6/11型感染率的檢測 根據(jù)HPV-6型L1基因(GenbankN0.：NC001668、AF067036、AF092932)第130位缺失、第131位為絲氨酸，HPV-11型L1基因(GenbankNo.：U55993、M14119)氨基酸序列第130和131位分別為甘氨酸和酪氨酸；以及H

12、PV-6和11型273-278氨基酸序列分別為IIKGSG和LVKGGN，采用PrimerDesigner軟件設(shè)計(jì)HPV-6和11型的特異性引物各一對，建立可同時檢測HPV-6和HPV-11型L1基因的雙重PCR。采用該雙重PCR，檢測116例患者尖銳濕疣組織標(biāo)本中HPV-6和HPV-11型L1基因片段。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，HPV-6和HPV-11型L1基因擴(kuò)增產(chǎn)物的預(yù)期大小分別為305bp和444bp。 結(jié)果

13、 1.目的基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果： 從編號H26尖銳濕疣組織DNA標(biāo)本中，擴(kuò)增獲得大小為1503bp的全長HPV-6L1基因片段。 2.目的基因克隆序列分析結(jié)果： 與報道的HPV-6L1基因序列比較，所克隆的全長HPV-6L1基因核苷酸和氨基酸序列同源性分別為99.20～99.93％和99.80～100％，T-A克隆和亞克隆序列完全相同。 3.rL1表達(dá)及其抗血清效價： 1.0、0.5、0.1mm

14、ol/LIPTG均能誘導(dǎo)rL1表達(dá)，但以0.1mmol/LIPTG誘導(dǎo)效果較好。rL1兔抗血清免疫雙擴(kuò)散效價為1：4。 4.尖銳濕疣標(biāo)本中L1蛋白的檢測結(jié)果： 5例陰性對照OD490均值±SD的值為0.17±0.06，故陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)為0.35。按上述判斷標(biāo)準(zhǔn)，88.8％尖銳濕疣組織標(biāo)本(103/116)的L1蛋白檢測結(jié)果陽性，其OD490值范圍為0.46～1.15。其中4例PCR結(jié)果陽性但ELISA結(jié)果陰性，未發(fā)現(xiàn)PCR

15、結(jié)果陰性而ELISA結(jié)果陽性者。 5.尖銳濕疵標(biāo)本中HPV11/6型的感染率： 116例患者尖銳濕疣組織標(biāo)本中，HPV-6和HPV-11L1基因檢測總陽性率為92.2％(107/116)。其中75例HPV-6L1基因檢測結(jié)果陽性，25例HPV-11L1基因檢測結(jié)果陽性，7例HPV-6和HPV-11L1基因檢測結(jié)果均陽性。 結(jié)論 1.本研究成功地構(gòu)建了HPV-6型L1基因高效原核表達(dá)系統(tǒng)； 2.建立