大腸桿菌來源的HPV6 L1重組蛋白的基礎(chǔ)及應(yīng)用研究.pdf

1、人乳頭瘤病毒（Human Papillomavirus HPV）能夠引起肛生殖器部位的多種良性及惡性病變。在HPV感染所致疾病中，尖銳濕疣是一種相當(dāng)常見的性傳播疾病。雖然該疾病為良性病變，但是具有反復(fù)發(fā)作，不易痊愈的特點(diǎn)，往往會(huì)給患者帶來沉重的心理壓力及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。尖銳濕疣主要由HPV6及HPV11感染所引起，其中由HPV6感染所引起的占到了70％。因此，一種有效的HPV6疫苗能夠顯著減少尖銳濕疣的發(fā)生和傳播。
　　 研究表明HP

2、V L1蛋白在體外組裝而成的類病毒顆粒(Virus-Like Particle VLP)是一種良好的HPV疫苗形式，可以誘導(dǎo)高滴度的抗HPV中和抗體。目前，已有兩種HPV VLP疫苗上市，其安全性及有效性也得到了充份的證實(shí)。但是上述兩種疫苗均采用真核表達(dá)系統(tǒng)，生產(chǎn)成本高，產(chǎn)品價(jià)格昂貴，難以在發(fā)展中國家推廣。而大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有培養(yǎng)條件簡單，生產(chǎn)成本低廉的突出優(yōu)點(diǎn)。若將其應(yīng)用于HPV6 VLP疫苗的研究中將能夠降低疫苗成本，促進(jìn)該疫苗在

3、發(fā)展中國家的推廣。本研究嘗試?yán)么竽c桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備具有良好免疫原性及穩(wěn)定的HPV疫苗，并對(duì)該疫苗的結(jié)構(gòu)及表位進(jìn)行分析。
　　 在本研究中并未以包涵體的形式在大腸桿菌中表達(dá)重組蛋白HPV6N5C-L1，而是將目的蛋白以非融合的形式可溶地表達(dá)于大腸桿菌中。所表達(dá)的HPV6N5C-L1蛋白在經(jīng)過鹽析沉淀，復(fù)溶，陽離子交換色譜，疏水相互作用色譜這一系列純化步驟之后，其純度能夠達(dá)到96％以上。經(jīng)純化的HPV6N5C-L1很好的保持了其天

4、然構(gòu)象，可以在緩沖液(10mmol/L PB pH6.0，150mmol/L NaCl)中組裝為半徑約為25nm左右的空心顆粒，具有典型的HPV6 VLP的形態(tài)結(jié)構(gòu)。
　　 在上述HPV6VLP小量制備方法基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步進(jìn)行了HPV6VLP疫苗的中試研究，以便建立高效，穩(wěn)定的HPV6 VLP中試工藝。研究結(jié)果顯示，該工藝不但具有25％左右的較高得率，而且對(duì)于目的蛋白具有良好的純化效果。經(jīng)過純化，目的蛋白的純度能夠達(dá)到96％

5、以上，而內(nèi)毒素，外源DNA含量均能夠符合藥典要求。此外，通過對(duì)三批次中試的觀察，證實(shí)了該工藝同時(shí)具有良好的穩(wěn)定性。
　　 中試研究所制備的HPV6VLP疫苗需要進(jìn)一步進(jìn)行免疫原性及穩(wěn)定性考察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本研究制備的HPV6 VLP疫苗的ED50為0.009μg，低于對(duì)照組中Merck HPV疫苗Gardasil的0.016μg。在穩(wěn)定性研究中，HPV6 VLP疫苗原液在25℃放置7Day后，其平均水化半徑，HPLC保留時(shí)間，

6、沉降系數(shù)，體外相對(duì)抗原含量均未發(fā)生明顯變化。在37℃放置7天后，HPV6 VLP的平均水化半徑有略微增大，而其余檢測指標(biāo)也未見明顯變化。上述研究結(jié)果證實(shí)了本研究所制備的HPV6 VLP具有良好的免疫原性及穩(wěn)定性。
　　 由于HPV VLP具有復(fù)雜的空間構(gòu)象，而且HPV疫苗的效果也嚴(yán)格依賴于其正確的空間構(gòu)象的形成。因此本研究在成功制備HPV6 VLP疫苗的基礎(chǔ)上進(jìn)一步對(duì)該疫苗的結(jié)構(gòu)及抗原表位進(jìn)行研究，以闡明HPV6 VLP的結(jié)構(gòu)及

7、表位特征，為建立全面的疫苗質(zhì)控體系及進(jìn)行疫苗設(shè)計(jì)奠定基礎(chǔ)。
　　 結(jié)構(gòu)分析顯示，組成大腸桿菌來源HPV6 VLP的五聚體在大小，分子量上均與理論值吻合，并且在一定條件下能夠形成晶體，具有正確的構(gòu)象。而HPV6 VLP為空心圓形顆粒，平均約半徑為25nm，表面可見殼粒，具有典型的HPV VLP的特征，與真核來源的HPV VLP無異。通過對(duì)多個(gè)中試批次樣品進(jìn)行分析，可以發(fā)現(xiàn)所制備的HPV6VLP在顆粒半徑，保留時(shí)間，沉降系數(shù)等指標(biāo)上

8、具有高度的一致性。
　　 在表位研究中，本研究篩選得到了HPV6優(yōu)勢中和單抗7A8，13H5，這兩株單抗同時(shí)還具有HPV6/11交叉中和活性。利用這兩株單抗模型與HPV6五聚體模型的分子對(duì)接，可以將HPV6的優(yōu)勢中和表位定位于HPV6VLP表面的DE，F(xiàn)G, HI三個(gè)環(huán)狀區(qū)域上。而后進(jìn)一步通過同源掃描的方法驗(yàn)證了上述對(duì)接結(jié)果，并且進(jìn)一步將上述表位定位于HPV6VLP表面的三個(gè)區(qū)域:V138N139V140G141，E259V26