小麥非生物脅迫相關LEA蛋白WZY1-2與WRAB18的功能研究.pdf

1、在植物的整個生命過程中，常會遭遇干旱、高鹽、高溫、冷害以及病蟲害等逆境脅迫，影響其正常生長。逆境可造成植物細胞不同程度的損傷，嚴重時將直接導致植株的死亡。逆境對植物的傷害主要表現(xiàn)在細胞脫水、膜系統(tǒng)遭到破壞、酶活性受影響以及胞內物質代謝紊亂等。植物在長期進化過程中也形成了各種防御機制來抵制這些不利因素對其自身的影響。胚胎發(fā)育晚期豐富表達蛋白（LEA蛋白），作為一類逆境相關蛋白，在植物逆境生理調控過程中發(fā)揮著重要作用。為探索該家族蛋白在植物

2、逆境脅迫中發(fā)揮的功能，本論文以LEA蛋白第二家族成員WZY1-2蛋白和第三家族成員WRAB18蛋白為研究對象，對二者在植物逆境脅迫下的功能進行了探討。
　　WZY1-2蛋白，為LEAⅡ家族蛋白（又稱脫水素、脫水蛋白）成員之一，具有該家族典型的保守序列:K片段和S片段，屬于SK3型脫水素，可受多種逆境信號分子誘導表達。本研究對脫水蛋白WZY1-2及其K、S片段分別缺失的衍生蛋白在植物細胞內的定位和存在形式進行了探討，確定了WZY1-

3、2蛋白在細胞中的定位及存在形式，并揭示了K片段或S片段的缺失對WZY1-2蛋白的亞細胞定位以及存在形式的影響;通過在大腸桿菌和本氏煙草細胞中對WZY1-2蛋白進行過表達，研究其在干旱、高鹽、高溫和低溫脅迫條件下對原核和真核生物抗逆性的影響。此外，本研究還通過蛋白與核酸互作的免疫共沉淀技術對脫水蛋白WZY1-2在細胞內的作用機理進行了初步探究。研究結果如下:
　　1.本研究從鄭引1＃小麥中克隆獲得wzy1-2基因ORF序列并在大腸桿

4、菌中進行表達，SDS-PAGE中蛋白大小為理論分子量大小的二倍，通過雙分子熒光互補(BiFC)試驗進一步證實WZY1-2蛋白以同源二聚體的形式存在于植物細胞。以wzy1-2基因ORF序列為模板，利用重疊延伸PCR技術對wzy1-2基因K、S片段分別進行缺失，獲得wzy1-2基因衍生物wzy1-2△K和wzy1-2△S，對二者分別進行二聚化驗證，結果顯示，分別缺失了K、S片段的衍生蛋白WZY1-2△K和WZY1-2△S在煙草葉片細胞內依然

5、以二聚體的形式存在，該現(xiàn)象表明K、S片段并不影響脫水蛋白WZY1-2的同源二聚化。
　　2.分別構建WZY1-2、WZY1-2△K以及WZY1-2△S蛋白與GFP融合的表達載體，通過在煙草葉片瞬時表達進行蛋白亞細胞定位分析，結果顯示，WZY1-2與WZY1-2△K蛋白定位于細胞核中。部分WZY1-2△S蛋白在細胞核中定位，但也有部分WZY1-2△S蛋白定位于細胞內膜和胞質中，由此可見，K片段對WZY1-2蛋白的核定位并無影響，而S

6、片段能夠影響WZY1-2的蛋白定位，但并不是決定因素。
　　3.將WZY1-2蛋白過表達的大腸桿菌BL21(DE3)菌株與作為對照的轉pET28a空載菌株同時進行干旱、高鹽、高溫和低溫脅迫，通過對比菌株生長狀況，證明WZY1-2蛋白能夠在逆境條件下提高大腸桿菌的生存能力;構建wzy1-2轉基因載體，利用農桿菌葉盤浸染，通過組織培養(yǎng)獲得wzy1-2轉基因煙草，以野生型煙草為對照，通過對煙草生長表型、根長、發(fā)芽率、種子活力以及氧化脅迫

7、相應生理指標進行分析，表明脫水蛋白WZY1-2可在多種非生物脅迫下增強煙草的抗逆性。
　　4.利用Ni2+柱對原核表達獲得的WZY1-2蛋白進行純化，并制備特異性抗體進行免疫共沉淀實驗，將WZY1-2蛋白與低溫脅迫36 h后小麥葉片基因組DNA共同孵育，對瓊脂糖珠所捕獲復合物分別進行核酸和蛋白電泳檢測，結果顯示，脫水蛋白WZY1-2能夠與核酸結合。
　　WRAB18蛋白，屬于LEAⅢ蛋白家族，具有LEAⅢ家族保守氨基酸序列(

8、TAQAAKEKAGE)。本研究確定了WRAB18蛋白在植物細胞內的定位及其在干旱、高鹽、高溫和低溫條件下，對乳酸脫氫酶(LDH)活性的保護作用。將WRAB18蛋白在大腸桿菌和煙草中進行過表達，探索其在干旱、高鹽、高溫和低溫四種非生物脅迫條件下對原核和真核生物的作用。同時，本研究克隆獲得了WRA B18基因全長及其上游啟動子序列，并對啟動子序列所包含的順式作用元件進行分析。研究結果如下:
　　1.構建WRAB18蛋白C端GFP融合

9、表達載體WRAB18-pA7GFP，通過農桿菌菌液注射使GFP∷WRAB18融合蛋白在煙草葉片瞬時表達。在GFP激光通道和mCherry通道下，利用激光共聚焦顯微鏡對煙草葉片細胞原生質體中GFP∷WRAB18融合蛋白和質體定位蛋白Marker(pt-rk CD3-999)進行共定位觀察，結果顯示，WRAB18蛋白定位于煙草葉片細胞質體中。
　　2.將純化的WRAB18蛋白與乳酸脫氫酶(LDH)溶液分別在干燥、高鹽、高溫和低溫條件下

10、共同孵育，酶活性分析表明，逆境條件下，含WRAB18蛋白的反應體系中LDH的酶活性明顯高于不含WRAB18蛋白的對照組。
　　3.將WRAB18蛋白分別在大腸桿菌BL21(DE3)和煙草中進行過表達，對大腸桿菌菌株以及轉基因煙草分別進行干旱、高鹽、高溫和低溫脅迫，與對照組進行比較，結果顯示WRAB18蛋白的過表達可在多種逆境脅迫下提高原核和真核細胞的抗逆性。
　　4.以小麥葉片基因組DNA為模板，克隆獲得WRAB18基因的全

11、長序列610bp，其中包含1個100 bp的內含子區(qū)域和2個分別為60bp、450 bp的外顯子區(qū)域?？寺～@得WRAB18基因上游2000 bp序列，經Plant CARE Database分析顯示，該序列包含TATA-box和CAAT-box等啟動子保守元件，并含有逆境脅迫相關順式作用元件: ABREs、GARE、LTREs、MBS等。利用實時熒光定量PCR技術對干旱、高鹽、高溫和低溫四種非生物脅迫后小麥幼苗葉片中WRAB18基因表達