加味升降散對(duì)IB病毒學(xué)及ARDS免疫學(xué)影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、一、研究目的探索中藥對(duì)SARS相關(guān)病毒學(xué)及免疫學(xué)的機(jī)理，以雞傳染性支氣管炎模型進(jìn)行SARS相關(guān)病毒學(xué)研究，以ARDS模型進(jìn)行SARS相關(guān)免疫學(xué)研究。 1、探討雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)的增毒傳代及幾種檢測(cè)方法，在體內(nèi)觀察加味升降散的抗病毒作用。 2、體外細(xì)胞培養(yǎng)觀察加味升降散的抗病毒、抑制病毒作用，以病毒蝕斑定量測(cè)定法揭示其可能的抗病毒機(jī)理。 3、建立小鼠ARDS模型及探討加味升降散改善ARDS模型小鼠血?dú)獾?/p>

2、作用。 4、探討加味升降散對(duì)ARDS模型小鼠氧自由基及炎性介質(zhì)的影響，并揭示其可能的抗氧化機(jī)理及細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。 5、探討加味升降散對(duì)ARDS模型小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的作用，并揭示其可能的免疫調(diào)節(jié)機(jī)理。 二、實(shí)驗(yàn)步驟1、IBV的傳代并檢測(cè)2、加味升降散對(duì)雞傳染性支氣管炎體內(nèi)模型的影響3、IBV蝕斑減數(shù)實(shí)驗(yàn)4、正常NIH小鼠動(dòng)脈血?dú)夥治?、肺系?shù)及百草枯LD50的測(cè)定5、小鼠ARDS模型的建立、加味升降散的急性毒性實(shí)

3、驗(yàn)及加味升降散對(duì)ARDS模型小鼠血?dú)獾挠绊?、加味升降散對(duì)MDA、SOD、NO的影響7、加味升降散對(duì)IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8及TNF-α的影響8、加味升降散對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞亞群的影響 三、實(shí)驗(yàn)方法1、按《動(dòng)物病毒學(xué)》的方法接種傳代IBV，NDV干擾法及侏儒胚實(shí)驗(yàn)均按《動(dòng)物病毒學(xué)》的方法。RT-PCR檢測(cè)方法：按RT-PCR試劑盒說(shuō)明書操作，最終產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳，電泳產(chǎn)物進(jìn)行紫外檢測(cè)并用mini-visiona

4、ryTM凝膠成像系統(tǒng)記錄試驗(yàn)結(jié)果。 2、IBV尿囊液，凍溶后緩慢滴入雛雞雙鼻、雙眼，然后隨機(jī)分為正常組，模型組，陽(yáng)性對(duì)照組，中藥大、中、小劑量，攻毒后10小時(shí)予以藥物治療，中藥大劑量組2：1、中劑量組1：1、小劑量組1：2濃縮，每只小鼠每天灌胃0.6ml，分兩次灌胃。陽(yáng)性藥物組予更昔絡(luò)韋10mg/kg，用蒸餾水配制后灌胃0.6ml/只，正常組及模型組灌等體積蒸餾水。共觀察9天，期間主要觀察雛雞的癥狀、大小便、死亡等指標(biāo)。

5、 i3、雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)按文獻(xiàn)方法進(jìn)行，培養(yǎng)一天后顯微鏡下觀察，細(xì)胞貼壁，滿視野見(jiàn)到致密的細(xì)胞單層即可以用于實(shí)驗(yàn)。雛雞肺和氣管等組織研缽好后倒入生理鹽水，并離心取上清，每管加雙抗(終濃度為1萬(wàn)單位/ml)后稀釋為10-1～10-99個(gè)稀釋度。將稀釋好的病毒接種于成纖維細(xì)胞上，放37℃、5％CO2的孵育箱中感作45～60分鐘。最后倒入配好的瓊脂糖，待凝固后將培養(yǎng)板倒過(guò)來(lái)，放在孵育箱中培養(yǎng)24～48小時(shí)。到時(shí)間觀察蝕斑形成情況并計(jì)蝕斑數(shù)。

6、 4、左手提取固定小鼠，右手持肝素鈉濕潤(rùn)的注射器盲穿小鼠心臟，抽動(dòng)脈血500ul左右，針頭迅速刺入橡皮塞，迅速送血?dú)夥治鰞x分析，小鼠尸體開胸取肺，電子天平稱重，濕肺重除以體重乘以100得肺系數(shù)。百草枯LD50的測(cè)定按汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院謝仰民教授等的方法，將實(shí)驗(yàn)小鼠分為48.64mg/kg、61.44mg/kg、76.8mg/kg、96mg/kg、120mg/kg、150mg/kg5個(gè)劑量組，一次性灌胃處理。共觀察14天，每日計(jì)死亡小

7、鼠數(shù)，24小時(shí)內(nèi)死亡不計(jì)入統(tǒng)計(jì)范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以寇氏法計(jì)算。 5、(1)ARDS模型的建立：將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為5組，即正常組、攻毒后1天、2天、3天、4天組，每組小鼠一次性灌百草枯0.18ml造模。攻毒后每天采血檢測(cè)血?dú)?。各組血?dú)饨Y(jié)果進(jìn)行比較分析。(2)加味升降散的急性毒性實(shí)驗(yàn)：將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為空白對(duì)照組，中藥大、中、小劑量組，實(shí)驗(yàn)前小鼠禁食(不禁水)12h后一次性灌不同濃縮度中藥0.3ml，空白對(duì)照組灌等體積蒸餾水。每天上、下午各觀

8、察一次，連續(xù)觀察1周，觀察記錄受試小鼠活動(dòng)、行為及死亡等情況，死亡小鼠及時(shí)進(jìn)行尸檢。(3)加味升降散對(duì)血?dú)獾挠绊懀簩?shí)驗(yàn)動(dòng)物分為正常對(duì)照組、模型組、中藥大、中、小劑量組，除正常對(duì)照組外一次性灌百草枯0.18ml造模，10小時(shí)后給藥治療，3天后抽動(dòng)脈血測(cè)血?dú)狻?shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)取肺臟用10％福爾馬林固定，進(jìn)行切片、HE染色，結(jié)果用光鏡觀察并拍照。 6、將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為5組，即正常對(duì)照組、中藥大、中、小劑量組，造模及治療方法同前。SOD、

9、MDA、NO測(cè)定均按其試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，最后按公式計(jì)算。7、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及造模、用藥方法同前。IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8及TNF-α檢測(cè)按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，最后按公式計(jì)算。 8、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及造模、用藥方法同前。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)摘除小鼠眼球取靜脈全血約0.5ml左右(抗凝)，取30ul全血于上樣管中，按T淋巴細(xì)胞亞群試劑盒說(shuō)明書加CD3、CD4、CD83種熒光抗體，避光孵育15～30分鐘，加1ml已配制好的1×溶血素，震

10、蕩混勻后孵育10～15分鐘，澄清之后1000rPm離心5分鐘，去上清，加500μlPBS重懸，混勻后上機(jī)檢測(cè)。 四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1、盲傳3代IBV，經(jīng)NDV干擾法測(cè)定其滴度：IBV的毒力在10-5～10-6之間。NDV的效價(jià)為1：1024。侏儒胚實(shí)驗(yàn)：其EID50為0.2毫升10-5.66，這與NDV干擾試驗(yàn)結(jié)果相符。RT-PCR法檢測(cè)IBV病毒，證實(shí)病毒RNA擴(kuò)增的大小約為1404bp，與預(yù)期值一致，說(shuō)明擴(kuò)增出的病毒為IBV病毒。

11、 2、攻毒第1天未見(jiàn)明顯異常，第2天出現(xiàn)輕微的癥狀，如精神不振，呆立等，第3天開始癥狀明顯，出現(xiàn)精神不振、咳嗽、甩鼻、抓鼻、引頸樣呼吸、打噴嚏、呆立、羽毛松亂、進(jìn)食減少、少數(shù)有氣管羅音，嚴(yán)重者出現(xiàn)呼吸困難。攻毒3～7天癥狀明顯，第8天開始癥狀減輕，雛雞開始活躍。攻毒第3天下午開始雛雞死亡，3～5天為死亡高峰期，第6天開始死亡減少，第8天始幾乎無(wú)死亡。 3、成纖維細(xì)胞培養(yǎng)所用的方法是半胚法，細(xì)胞貼壁好、生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)時(shí)間短

12、，可以提高效率。培養(yǎng)時(shí)間一般為24～48小時(shí)，本實(shí)驗(yàn)采用培養(yǎng)1天后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛、形態(tài)良好。病毒接種于成纖維細(xì)胞后成功形成了蝕斑，我們把病毒稀釋了9個(gè)濃度，10-1～10-9，10-1～10-6稀釋度，模型組和藥物組比較差異顯著，用藥組蝕斑明顯減少。當(dāng)稀釋到10-7時(shí)藥物組蝕斑很少，故未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。 4、正常NIH小鼠動(dòng)脈血PaO2(KPa)范圍為10.77～14.83(12.07±1.27)：PaCO2(KPa)范

13、圍為3.05～6.26(4.58±1.02)；肺系數(shù)范圍(％)為0.41～0.76(0.58±0.099)：PQ經(jīng)口染毒LD50為87.096mg/kg。 5、攻毒后第2天開始PaO2、PaO2/FiO2等指標(biāo)均明顯下降，PaCO2均顯著增高，與正常組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，P＜0.01。 6、SOD：造模后指標(biāo)明顯下降，和正常組比較，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)，P＜0.01，用藥后指標(biāo)呈不同程度升高，和模型組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異明顯；MD

14、A：造模后指標(biāo)明顯升高，模型組與正常組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，治療后指標(biāo)明顯下降，各中藥組與模型組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異非常顯著，P＜0.01；NO：模型組指標(biāo)和正常組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，P＜0.01，用藥后指標(biāo)不同程度下降，和模型組比較，有非常顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01。 7、IL-1β：模型組指標(biāo)顯著高于正常組，P＜0.01，大劑量組和中劑量組與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；IL-2：模型組指標(biāo)顯著低于正常組，P＜0.01，大劑量

15、組、中劑量組與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，大、中劑量組與模型組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，P＜0.01，小劑量組與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；IL-6：模型組和各中藥組與正常組相比，指標(biāo)均升高，P＜0.01，大、中、小劑量組與模型組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，P＜0.01；IL-8：造模后指標(biāo)明顯上升，和正常對(duì)照組比較，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，經(jīng)治療后指標(biāo)不同程度下降，和模型組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，說(shuō)明治療后指標(biāo)明顯下降；TNF-α：模型組的指標(biāo)比正常組明顯

16、升高，P＜0.01，各中藥組與模型組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，P均＜0.01，大、中、小劑量比較，無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05。 8、CD3、CD4、CD8各指標(biāo)造模后明顯下降，與正常對(duì)照組比較，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異均顯著，P＜0.01或P＜0.05。 五、結(jié)論1、我們通過(guò)NDV干擾法、侏儒胚實(shí)驗(yàn)、RT-PCR法檢測(cè)盲傳3代的IBV病毒，明確了所傳病毒確為IBV病毒，其EID50為10-5.66。 2、加味升降散能抑制病毒，

17、提高雛雞抵抗力，增強(qiáng)抗病毒能力，能較好地改善癥狀，減少死亡率，中藥有一定死亡保護(hù)作用。 3、加味升降散能減少病毒蝕斑的形成，有較好的抑制病毒、抗病毒能力。 4、受試藥物在設(shè)計(jì)的劑量范圍內(nèi)是安全的，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)毒性；加味升降散能明顯改善模型小鼠血?dú)?，有升高PaO2降低PaCO2作用，并能減輕ARDS模型小鼠癥狀，改善模型小鼠病理?yè)p害。 5、加味升降散有抗氧化作用，從而改善病理?yè)p害。 6、加味升降散能夠增強(qiáng)巨