骨橋蛋白異構(gòu)體在胃癌中的生物學(xué)作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:本課題組前期研究顯示骨橋蛋白(OPN)在胃癌中高表達(dá)，且與較差的預(yù)后相關(guān)。OPN功能廣泛，而mRNA前體經(jīng)選擇性剪切后拼接則是其重要的調(diào)控方式，不同的外顯子拼接后可以形成OPN-a、OPN-b與OPN-c三種形式異構(gòu)體。本課題旨在通過研究骨橋蛋白三種異構(gòu)體在胃癌中的表達(dá)、生物學(xué)作用和分子機(jī)制，闡明OPN異構(gòu)體在胃癌發(fā)生發(fā)展中的意義，為臨床上指導(dǎo)診斷與治療提供依據(jù)。
　　方法:通過定量PCR，對101例胃癌患者腫瘤組織、9株胃

2、癌細(xì)胞與1株永生化胃粘膜細(xì)胞中的OPN三種異構(gòu)體表達(dá)情況進(jìn)行檢測，然后收集101例胃癌患者臨床病理特征參數(shù)并結(jié)合OPN異構(gòu)體的表達(dá)分析相關(guān)性。同時(shí)運(yùn)用胃癌中高表達(dá)的EGF、HGF、IGF-I與PDGF生長因子刺激胃癌微環(huán)境中的癌細(xì)胞和癌相關(guān)成纖維細(xì)胞，觀察OPN三種異構(gòu)體的表達(dá)變化。
　　選擇表達(dá)內(nèi)源性O(shè)PN異構(gòu)體較低的MKN45與SGC7901細(xì)胞，分別構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)OPN三種異構(gòu)體的胃癌細(xì)胞株和穩(wěn)定表達(dá)空載質(zhì)粒的對照細(xì)胞株，然

3、后進(jìn)行細(xì)胞增殖、克隆形成、抗凋亡、轉(zhuǎn)移與侵襲等一系列體外實(shí)驗(yàn)，觀察胃癌細(xì)胞中OPN異構(gòu)體各自發(fā)揮的生物學(xué)功能。進(jìn)一步選擇體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行裸鼠皮下成瘤與尾靜脈轉(zhuǎn)移成瘤實(shí)驗(yàn)，觀察在體內(nèi)OPN異構(gòu)體對胃癌生長和轉(zhuǎn)移的影響。
　　對胃癌細(xì)胞過表達(dá)OPN異構(gòu)體后下游凋亡相關(guān)蛋白、受體分子CD44v5～v7、侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)分子MMP2和uPa、趨化因子CCL5與IL8等改變情況進(jìn)行檢測，從而深入探討OPN異構(gòu)體影響胃癌細(xì)胞抗凋亡能力與促胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移

4、能力的機(jī)制。
　　結(jié)果:OPN三種異構(gòu)體在胃癌組織中均表達(dá)升高，其中OPN-b升高幅度最大。OPN-b高表達(dá)與胃癌原發(fā)灶的大小、侵襲深度和TNM分期相關(guān)，OPN-c高表達(dá)則與胃癌侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期相關(guān)。此外，OPN-b是胃癌細(xì)胞中最主要表達(dá)的OPN異構(gòu)體，而OPN-c在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)高于其在永生化胃粘膜細(xì)胞中的表達(dá)。當(dāng)以生長因子EGF、HGF、IGF-I與PDGF刺激后，胃癌細(xì)胞內(nèi)OPN-b表達(dá)升高最明顯，而胃癌相

5、關(guān)成纖維細(xì)胞內(nèi)OPN-c表達(dá)升高最明顯。
　　胃癌細(xì)胞過表達(dá)OPN異構(gòu)體后，OPN-a、OPN-b與OPN-c均具有促進(jìn)增殖、克隆形成和體內(nèi)成瘤能力，其中以O(shè)PN-b能力最強(qiáng)，OPN-a能力最弱。OPN-b和OPN-c均能協(xié)助胃癌細(xì)胞抗過氧化氫刺激后的凋亡，且OPN-b能力更強(qiáng)。OPN-b與OPN-c的抗凋亡能力主要通過上調(diào)CD44異構(gòu)體受體CD44v5～v7，從而促進(jìn)OPN與CD44v受體結(jié)合并啟動CD44v相關(guān)的細(xì)胞存活通路，

6、達(dá)到調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，保護(hù)胃癌細(xì)胞免受凋亡的目的。
　　胃癌中OPN三種異構(gòu)體過表達(dá)均可增強(qiáng)胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲功能，但在體內(nèi)僅OPN-b和OPN-c具有促胃癌細(xì)胞血行轉(zhuǎn)移至肝臟的能力，且OPN-c能力更強(qiáng)。OPN異構(gòu)體促腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力主要通過升高侵襲相關(guān)分子MMP-2與趨化因子IL8的表達(dá)，而OPN-c則尚可升高趨化因子CCL5與侵襲相關(guān)分子uPa的分泌，從而介導(dǎo)更強(qiáng)大的胃癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力。
　　結(jié)論:OPN三