應(yīng)用熒光檢測法分析AMPA受體N末端結(jié)構(gòu)域的相互作用.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、AMPA受體介導(dǎo)了中樞神經(jīng)系統(tǒng)絕大部分快速型的興奮性突觸傳遞。在海馬中大部分AMPA受體是以含GluR2的異四聚體的形式存在。AMPA受體的裝配以一種“二聚化后二聚化”的模型進行裝配。雖然在離子型谷氨酸受體的首次裝配過程中，N末端結(jié)構(gòu)域(NterminaldomainNTD)起了一定的作用，但是還不清楚在活細胞中和完整的受體中NTD的相互作用的情況。我們采用熒光檢測法包括雙分子熒光互補法(bimolecularfluorescencec

2、omplementationBiFC)和熒光共振能量轉(zhuǎn)移法(FluorescenceResonanceEnergyTransferFRET).來研究NTD的相互作用。BiFC是熒光蛋白在合適的位點打開，并標(biāo)記目標(biāo)蛋白，當(dāng)這兩片段標(biāo)記的蛋白兩兩相互作用時，熒光蛋白能正確折疊并重建熒光團。為了方便后續(xù)的工作，我們首先構(gòu)建了胞漿型和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)型(endoplasmicreticuliumER)的表達載體。在HEK293和COS7細胞內(nèi)對游離的AM

3、PA受體GluR1亞單位的NTD進行了雙分子熒光互補檢測，可見黃色的熒光。證實在活細胞中，無論在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中還是在胞漿中，它們都能形成二聚體。為了排除蛋白之間非特異性的相互作用，我們選用代謝性谷氨酸受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(metabotropicglutamatereceptorligandbindingdomainmGluR1-LBD)作為陰性對照，可見微弱的非特異的相互作用.。為了檢測在完整的受體中GluR1NTD的相互作用，采用了FRE

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