FoxO3a信號(hào)網(wǎng)絡(luò)在幽門(mén)螺桿菌感染中的作用.pdf

1、研究背景：
　　 在全球所有與癌癥相關(guān)的死亡當(dāng)中，胃癌居于第二位，并且胃癌是消化科最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。大量研究證實(shí)幽門(mén)螺桿菌感染與胃癌的發(fā)生有密切的關(guān)系。世界衛(wèi)生組織已將幽門(mén)螺桿菌列為胃癌的頭號(hào)致癌因子。全球感染幽門(mén)螺桿菌的自然人群比率超過(guò)總?cè)丝跀?shù)的一半。目前，我們知道幽門(mén)螺桿菌與多種胃、十二指腸等消化道疾病有密不可分的關(guān)系，但其確切的致病機(jī)制至今尚未明確。
　　 Forkhead(Fox)蛋白家族于2000年正式發(fā)布

2、并被統(tǒng)一命名，目前被分為17個(gè)亞家族，其中對(duì)O亞家族(FoxO)的研究最為廣泛及深入，它主要通過(guò)調(diào)控下游的靶基因如Bim，p27、CyclinD1等的轉(zhuǎn)錄水平，從而在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期阻滯、DNA修復(fù)及氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。前期研究表明Hp可激活人正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1細(xì)胞中的PI3K-Akt信號(hào)通路，進(jìn)而引起細(xì)胞增殖、凋亡的紊亂。FoxO3a是Akt下游的靶分子之一，但Hp對(duì)FoxO3a的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本課題圍繞Fo

3、xO3a轉(zhuǎn)錄因子在Hp相關(guān)性胃粘膜疾病中的變化展開(kāi)，并探討Hp刺激對(duì)胃粘膜細(xì)胞株中FoxO3a轉(zhuǎn)錄因子及其下游靶分子Bim，p27、CyclinD1影響。
　　 研究目的：
　　 1、研究FoxO3a轉(zhuǎn)錄因子在非萎縮性胃炎→腸上皮化生→不典型增生→胃癌這一胃粘膜病變過(guò)程中的變化，進(jìn)而探討其臨床意義。
　　 2、研究不同濃度的Hp作用于GES-1細(xì)胞不同時(shí)間后，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的存活率的影響；并從翻譯后蛋白表達(dá)水平及mR

4、NA水平檢測(cè)FoxO3a、pFoxO3a、p27、CyclinD1及Bim的表達(dá)，探討Hp感染對(duì)FoxO3a信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的影響。
　　 研究方法：
　　 1、體內(nèi)研究部分
　　 選取南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院2007年1月至2009年9月胃鏡活檢或外科手術(shù)病理標(biāo)本共149例，其中非萎縮性胃炎(ChronicNon-AtrophicGastritis，CNAG)36例，化生性萎縮性胃炎(ChronicMetaphasticA

5、trophyGastritis，CMAG)36例，異型增生(Dysplasia，Dys)38例，胃癌(GastricCancer，GC)39例為研究對(duì)象。采用免疫組織化學(xué)PV-9000二步法檢測(cè)FoxO3a及pFoxO3a的表達(dá)。
　　 2、體外研究部分
　　 (1)顯微鏡下觀察不同濃度的Hp作用于GES-1細(xì)胞后發(fā)生的形態(tài)學(xué)改變。
　　 (2)采用四唑藍(lán)(MTT)比色試驗(yàn)檢測(cè)Hp按100:1、50:1及25:1

6、的濃度作用于GES-1細(xì)胞后對(duì)其存活率的影響。
　　 (3)采用western-blot蛋白印跡(WB)法檢測(cè)Hp按300:1、150:1及50:1的濃度作用于GES-1細(xì)胞后FoxO3a、pFoxO3a、p27及CyclinD1蛋白表達(dá)水平的變化。
　　 (4)采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)UP按300:1、150:1及50:1的濃度作用于GES-1細(xì)胞后FoxO3a、bim及p27mRNA表達(dá)水平的變化。
　　 研

7、究結(jié)果：
　　 1、體內(nèi)研究部分：
　　 (1)對(duì)Hp陽(yáng)性的CNAG、CAG伴IM、DYS與GC組不同胃粘膜病變標(biāo)本中的FoxO3a進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在這四組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.183>0.05)。在Hp陰性的CNAG、CAG伴IM、DYS與GC組不同胃粘膜病變標(biāo)本中FoxO3a進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以上四組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.018<0.05)，表現(xiàn)為FoxO3a在胃黏膜病變發(fā)展進(jìn)程中呈降低趨勢(shì)，并且在同一病變階段中

8、Hp陰性組FoxO3a，的表達(dá)高于Hp陽(yáng)性組。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)FoxO3a蛋白的表達(dá)量在Hp感染陰性與陽(yáng)性組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，表現(xiàn)為在Hp感染陰性組中FoxO3a蛋白呈高表達(dá)，而在Hp感染陽(yáng)性組中FoxO3a蛋白呈低表達(dá)。
　　 (2)對(duì)Hp陽(yáng)性CNAG、CAG伴IM、DYS與GC組不同胃粘膜病變的標(biāo)本中的pFoxO3a進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在這四組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.088>0.05)。在Hp陰性的CNAG、CAG伴

9、IM、DYS與GC組不同胃粘膜病變標(biāo)本中，pFoxO3a在以上四組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.008<0.05)，表現(xiàn)為pFoxO3a在早期胃黏膜病變中呈下降趨勢(shì)，但到胃癌時(shí)呈有升高趨勢(shì)。分析pFoxO3a的表達(dá)量與Hp感染的關(guān)系結(jié)果表明，在Hp感染陽(yáng)性與陰性組中pFoxO3a的表達(dá)量無(wú)明顯差異(P<0.05)。
　　 2、體外研究部分：
　　 (1)顯微鏡下觀察到Hp活菌作用于GES-1細(xì)胞24h后細(xì)胞發(fā)生典型的凋亡改變。

10、鏡下可見(jiàn)細(xì)胞輪廓逐漸變模糊，呈拉絲狀，有空泡形成，且更為分散，逐漸脫壁，培養(yǎng)液中可見(jiàn)細(xì)胞凋亡崩解后顆粒狀的產(chǎn)物。作用時(shí)間越長(zhǎng)、作用濃度越高凋亡改變更明顯。
　　 (2)MTT檢測(cè)Hp對(duì)GES-1細(xì)胞存活率的影響。我們發(fā)現(xiàn)Hp活菌按不同的濃度比例作用于GES-1后在對(duì)其存活率是有影響的，有明顯的統(tǒng)計(jì)差異(P<0.05)。在100:1，50:1及25:1這三個(gè)不同濃度的Hp活菌作用于GES-1不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)對(duì)細(xì)胞存活率的影響并不全都有

11、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在0h時(shí)100:1的存活率明顯高于50:1組及25:1組，(P=0.004<0.05)，隨著作用濃度的降低其存活率也有所降低，在12h時(shí)細(xì)胞的存活率稍有升高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.035<0.05)，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，存活率迅速下降，當(dāng)作用時(shí)間達(dá)48h時(shí)，100:1組的存活率明顯低于50:1級(jí)及25:1組，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.000<0.05)，其余時(shí)間點(diǎn)在各濃度間無(wú)明顯差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　

12、　 (3)Westernblot檢測(cè)Hp活菌對(duì)：FoxO3a、pFoxO3a、p27及CyclinD1蛋白表達(dá)的影響。我們觀察到Hp在按100:1及150:1的濃度作用于GES-1細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)FoxO3a，的表達(dá)量是有差異的(P<0.05)，具體表現(xiàn)為在0.5h時(shí)就開(kāi)始呈現(xiàn)增高的趨勢(shì)，作用一段時(shí)間后達(dá)到峰值，之后呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，但是150:1組的峰值(3h)要早于100:1組(6h)，并且不難發(fā)現(xiàn)

13、在Hp作用24h后FoxO3a的表達(dá)明顯低于0h組。300:1組則未見(jiàn)明顯差異(P>0.05)。pFoxO3a的表達(dá)水平在這三個(gè)濃度組中均未見(jiàn)明顯差異(P>0.05)。P27的表達(dá)在100:1組與150:1組中均呈現(xiàn)隨作用時(shí)間延長(zhǎng)，先升高后下降，變化趨勢(shì)與FoxO3a基本一致。100:1與150:1兩組中，不同時(shí)間點(diǎn)的CyclinD1表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，表現(xiàn)為逐漸升高，但在24h時(shí)難以檢測(cè)出，在300:1組的前6h表達(dá)基

14、本一致，但12h表達(dá)量開(kāi)始下降，24h亦難以檢測(cè)出。
　　 (4)Real-timePCR檢測(cè)FoxO3a在三個(gè)濃度的Hp作用時(shí)其mRNA表達(dá)量是有變化的，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，在100:1及150:1的作用濃度中FoxO3amRNA表達(dá)量隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)有先增高后降低的趨勢(shì)，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，在300:1組則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。p27mRNA在三種Hp濃度作用時(shí)其mRNA表達(dá)量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)

15、意義(P<0.05)，在不同濃度作用時(shí)僅在150:1組Hp作用于GES-1是有差異的(P<0.05)，呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì)，在100:1組及300:1組中則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，也未見(jiàn)明顯趨勢(shì)。BimmRNA的表達(dá)量在100:1組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，其余組均無(wú)明顯差異。這一結(jié)果與Westernblot檢測(cè)的結(jié)果不盡一致，但是我們知道對(duì)于某個(gè)基因的調(diào)節(jié)也存在轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)，也就是說(shuō)轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平不一定是完全一致的，因

16、為存在mRNA的修飾、運(yùn)輸、降解及其他一些小分子量RNA，如miRNA的調(diào)節(jié)，故某一個(gè)分子的mRNA表達(dá)量與蛋白表達(dá)量并不一定呈正相關(guān)。
　　 結(jié)論：
　　 1、FoxO3a轉(zhuǎn)錄因子參與了Hp所致胃粘膜相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，并且與Hp的早期致病作用有關(guān)。
　　 2、不同濃度的Hp活菌作用于正常胃黏膜上皮細(xì)胞時(shí)產(chǎn)生的作用不同。低濃度的Hp可在早期發(fā)揮促凋亡的作用，晚期在各種因素的影響下產(chǎn)生促增殖作用，但高濃度的H

17、p則在早期就起著促凋亡的作用，其發(fā)揮的促凋亡作用與時(shí)間無(wú)明顯關(guān)系。
　　 3、FoxO3a與p27隨著Hp作用時(shí)間延長(zhǎng)在正常胃黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)變化趨勢(shì)基本一致，都有先增高后降低的趨勢(shì)，但是發(fā)生改變的時(shí)間點(diǎn)有所不同，CyclinD1隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)其表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，Bim的表達(dá)無(wú)明顯變化趨勢(shì)，但在長(zhǎng)時(shí)間Hp的作用下表達(dá)量有所下降。因此在Hp感染的過(guò)程中。FoxO3a可根據(jù)細(xì)胞的受損程度通過(guò)調(diào)控其下游物靶基因產(chǎn)生相應(yīng)的改變，從