雞IL-18cDNA基因的克隆表達(dá)及其對(duì)柔嫩艾美耳球蟲DNA疫苗的免疫增強(qiáng)作用.pdf

1、雞球蟲病是雞球蟲寄生在細(xì)胞內(nèi)的原蟲疾病，給養(yǎng)禽業(yè)所帶來的經(jīng)濟(jì)損失較為嚴(yán)重。實(shí)踐證明，早期臨床抗球蟲藥控制和活蟲苗的應(yīng)用，在養(yǎng)禽業(yè)球蟲的防治上具有重要作用。但大量耐藥株以及活苗使用的不方便和低保護(hù)率，促使科學(xué)家不斷地追求抗球蟲的新方法。非藥物性防治不斷引起了人們的興趣，重組抗球蟲基因工程疫苗的研究亦獲得了較快的發(fā)展。細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫方面具有重要作用，不同的細(xì)胞因子類型誘導(dǎo)調(diào)節(jié)不同的免疫應(yīng)答類型。IL-18的細(xì)胞來源種類較多，它可誘導(dǎo)

2、Th1型細(xì)胞因子以及某些趨化因子受體的表達(dá)，如IFN-γ、GM-CSF、TNF-a、IL-1等。在特定的組織環(huán)境中，IL-18亦可誘導(dǎo)Th2型細(xì)胞因子的分泌，如lL-13、IL-4等。 以LPS激活14日齡羅曼氏雛雞脾細(xì)胞，提取總mRNA，以RT-PCR法擴(kuò)增編碼雞成熟IL-18蛋白的cDNA，目的基因重組于原核表達(dá)載體pBAD／myc-his B，并在大腸桿菌Top10中表達(dá)，用SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物。結(jié)果表明，成功克隆

3、到了雞成熟IL-18基因，其大小為510個(gè)核苷酸，編碼170個(gè)氨基酸；目的基因在L-(+)-阿拉伯糖誘導(dǎo)下獲得成功表達(dá)，表達(dá)蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為18.7KD。 為了探索重組rIL-18體外促進(jìn)雞巨噬細(xì)胞吞噬和NO分泌的效應(yīng)，本試驗(yàn)檢測(cè)了雞激活腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)中性紅的吞噬能力，并測(cè)定rIL-18作用于巨噬細(xì)胞后細(xì)胞培養(yǎng)液中NO的濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)雞rlL-18復(fù)性蛋白(≥200ng／mL)可顯著提高巨噬細(xì)胞體外吞噬中性紅和分泌NO的能力

4、，且在一定的劑量范圍內(nèi)，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，1000ng／ml復(fù)性蛋白的巨噬細(xì)胞吞噬和NO分泌效應(yīng)與200ng／ml相當(dāng)。lFN-γ抗血清可以干擾巨噬細(xì)胞的NO分泌，但不干擾巨噬細(xì)胞的吞噬。 利用DNA重組技術(shù)，將雞成熟IL-18完整閱讀框(ORF，510bp)和柔嫩艾美耳球蟲(E.tenalla)第2代裂殖子抗原基因MZ5-7的完整閱讀框(ORF，945bP)以共表達(dá)的形式克隆到真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1.0，分別構(gòu)建了DNA疫苗

5、pVAX1.0-IL-18和pVAX1.0-MZ5-7。用同樣方法，將MZ5-7重組于IL-18基因的上游，構(gòu)建成免疫調(diào)節(jié)型DNA疫苗pVAX1.0-MZ5-7-IL-18。三種DNA疫苗純化后，肌肉注射免疫一周齡雛雞(150μg/羽)，免疫后第八天取注射部位和非免疫雞對(duì)應(yīng)部位肌肉組織，以進(jìn)行RT-PCR方法檢測(cè)目的基因的轉(zhuǎn)錄情況；免疫后第十天，以Western blotting方法檢測(cè)抗原基因表達(dá)情況。結(jié)果表明，三種疫苗免疫后第八天，

6、用RT-PCR方法在注射部位分別檢測(cè)到相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，三種重組疫苗在雞體內(nèi)均獲得表達(dá)。 proMZ5-7＋prolL-18、prolL-18＋pVAX1.0-MZ5-7、proMZ5-7＋pVAX1.0-IL-18、pVAX1.0-IL-18、pVAX1.0-MZ5-7、pVAX1.0-MZ5-7-IL-18經(jīng)腿部肌肉注射于14日齡雛雞，21日齡加強(qiáng)免疫一次，設(shè)立感染非免疫和非感染非免疫對(duì)

7、照組。28日齡經(jīng)口接種新鮮的E tenella孢子化卵囊，一周后宰殺全部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并進(jìn)行平均盲腸病變記分、平均增重、克盲腸內(nèi)容物卵囊數(shù)和抗球蟲指數(shù)指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明，所構(gòu)建的IL-18免疫調(diào)節(jié)型核酸疫苗對(duì)感染球蟲雞具有一定的保護(hù)效果，其中以pVAX1.0-MZ5-7-IL-18和prolL-18＋pVAX1.0-MZ5-7組有良好的保護(hù)效果，其病變記分分別為1.97、1.93，ACI為178.09、177.33。pVAX1.O-I