第三種氣體信號分子H2S在LPS所致大鼠ALI中的作用及其機(jī)制初探.pdf

1、目的：急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是一組除心源性因素以外，由其它各種致病因素造成的急性彌漫性肺泡上皮、肺微血管內(nèi)皮和肺間質(zhì)損傷，從而引起以彌漫性肺泡和間質(zhì)水腫，臨床表現(xiàn)為急性、進(jìn)行性、缺氧性呼吸衰竭的肺部炎癥綜合征，進(jìn)而可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)。肺動(dòng)脈高壓(pulmonaryartery hypertension，PAH)為

2、其血流動(dòng)力學(xué)特征，它是促進(jìn)肺泡水腫和間質(zhì)水腫的重要因素之一。臨床上造成ALI的原因中，細(xì)菌內(nèi)毒素占有著重要的地位，其中又以革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素為主導(dǎo)，而其內(nèi)毒素的主要活性成份為脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是導(dǎo)致ALI的主要因素。而中性粒細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophil，PMN)則可能是造成過度炎性反應(yīng)的元兇。
　　 在機(jī)體遭到LPS入侵后，將會(huì)激活體內(nèi)的酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)產(chǎn)生

3、大量的自由基，同時(shí)出現(xiàn)自由基清除系統(tǒng)的活性下降，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)則是自由基清除系統(tǒng)的代表，它的活性反映了機(jī)體抗氧化的能力。而產(chǎn)生的自由基則會(huì)攻擊生物膜，使膜脂質(zhì)過氧化，造成細(xì)胞損傷。在氧化與抗氧化反應(yīng)中丙二醛(malondialdehyde，MDA)是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一，它的高低可以間接地反映細(xì)胞受自由基攻擊后所致?lián)p傷的程度。
　　 同時(shí)對于組成機(jī)體的組織細(xì)胞而言，細(xì)胞的增值、

4、分化、凋亡始終貫穿于生命的整個(gè)過程并有序的進(jìn)行著。細(xì)胞內(nèi)存在著抗凋亡因子[如：B細(xì)胞淋巴瘤2基因(B-cell lymphoma-2 gene，Bcl-2)等]及促凋亡因子(如Fas等)，他們相互作用制約著，維持著恰當(dāng)?shù)膭?dòng)態(tài)平衡。但當(dāng)機(jī)體受到LPS入侵這一刺激后，兩者之間適當(dāng)?shù)膭?dòng)態(tài)平衡被破壞，凋亡因子占據(jù)了主導(dǎo)地位，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡加速，組織損傷加重。
　　 PMN在肺內(nèi)過度募集、黏附、活化、遷移及延遲凋亡是導(dǎo)致過度炎性反應(yīng)的關(guān)鍵，

5、而血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的黏附分子[如：細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecules，ICAM-1)]及CD11b表達(dá)的上調(diào)則在其過度度募集、黏附、遷移過程中起著重要的作用。而CD11b不但可以促進(jìn)髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)與PMN結(jié)合以及隨后的PMN脫顆粒和超氧化物的產(chǎn)生，而且還可以增強(qiáng)MPO的延遲PMN凋亡作用。
　　 盡管目前對ALI機(jī)制的認(rèn)知有了很大

6、的進(jìn)步，但至今臨床上對如何有效的阻止ALI進(jìn)展成為ARDS或MODS，仍未找到切實(shí)有效的方法。而ARDS和MODS在全球的病死率也仍居高不下。因此，深入探討ALI的發(fā)病機(jī)制，將ARDS消滅在萌芽狀態(tài)，即如何防治ALI的發(fā)生與發(fā)展，是當(dāng)今該領(lǐng)域亟待解決的重要課題。
　　 硫化氫(bydrogen sulfide，H2S)是新近被發(fā)現(xiàn)的，除了一氧化氮(nitrogen monoxide，NO)和一氧化碳(carbon monoxid

7、e，CO)外已被證實(shí)的人體能自身生成，且有著多種病理生理作用的生物學(xué)功能的第三種內(nèi)源性氣體信號分子。雖然現(xiàn)在已證實(shí)了H2S在對抗內(nèi)毒素休克時(shí)的肺損傷及升高的肺動(dòng)脈壓中起到了一定的作用，但尚缺乏足夠的認(rèn)識，因此我們做了本實(shí)驗(yàn)，試圖從以下兩個(gè)方面來初步探討其作用機(jī)制：1、H2S在LPS所致急性肺損傷中的作用；2、H2S在抗LPS所致急性肺損傷時(shí)對PMN的影響。
　　 一 H2S在LPS所致急性肺損傷中的作用
　　 方法：將2

8、10只大鼠，隨機(jī)分為6組，每組35只，其中7只大鼠用于測量其mPAP，再分別取28只于給藥后4h或8h進(jìn)行觀察(其中，14只用于支氣管肺泡灌洗，另14只不行支氣管肺泡灌洗)。①鹽水對照組(Control組)：氣管內(nèi)滴注無熱原生理鹽水(normal saline，NS，200μl·只-1)；②LPS組：氣管內(nèi)滴注LPS(200μg·200μl-1·只-1)；③LPS+NaHS(H2S供體)組：氣管內(nèi)滴注LPS前15 min經(jīng)腹腔注射0.5

9、ml NaHS(28μmol·kg-1)：@LPS+PPG(CSE抑制劑)組：氣管內(nèi)滴注LPS前15 min經(jīng)腹腔注射0.5ml PPG(45μmol·kg-1)；⑤NaHS組：氣管內(nèi)滴注NS前15 min經(jīng)腹腔注射0.5ml NaHS(28μmol·kg-1)；⑥PPG組：氣管內(nèi)滴注NS前15 min經(jīng)腹腔注射0.5ml PPG(45μmol·kg-1)。
　　 各組均于4h或8h時(shí)經(jīng)頸總動(dòng)脈放血處死動(dòng)物，再行支氣管肺泡灌洗(

10、bronchoalveolar lavage，BAL)，而后收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)。沒有進(jìn)行BAL的動(dòng)物摘取全肺稱重后，留取肺組織。采用生化方法檢測肺組織SOD活性和MDA含量；免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測肺組織Bcl-2、Fas蛋白表達(dá)變化；光鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)變化并計(jì)算肺泡損傷數(shù)比值作為肺損傷的組織學(xué)定量評價(jià)指標(biāo)(index of quantitative assessm

11、ent，IQA)，右心導(dǎo)管法測定平均肺動(dòng)脈壓。
　　 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析。對PMN數(shù)量采用多樣本均數(shù)比較的秩和檢驗(yàn)及兩兩比較的秩和檢驗(yàn)，在各時(shí)間點(diǎn)所有變量的差異用單因素方差分析(one-way ANOVA)來檢驗(yàn)，先進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)，滿足方差齊性要求時(shí)組間比較采用LSD法，不滿足方差齊性要求時(shí)組間比較采用Dunnett's T3法。雙變量的相關(guān)分析用直線相關(guān)分析法分析。以P

12、<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：LPS組與對照組相比，大鼠的肺系數(shù)、BALF中的蛋白含量、IQA均增大，MDA含量顯著增加，SOD活性降低，光鏡下可見肺組織出現(xiàn)損傷。PPG+LPS組與LPS組相比，大鼠的肺系數(shù)、肺組織和BALF中的蛋白含量、IQA增大的更為顯著，MDA含量明顯增加，SOD活性降低，光鏡下可見肺組織損傷也更重；NaHS+LPS組與上述兩組(PPG+LPS組和LPS組)相比大鼠的肺系數(shù)、肺組織和BALF中的

13、蛋白含量、IQA均明顯減小，MDA含量減少，SOD活性升高，光鏡下見肺組織損傷較上兩組也明顯減輕。與對照組相比，LPS組大鼠肺組織中Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，(P均<0.01)；Fas蛋白表達(dá)的陽性信號明顯增多，(P均<0.01)。與LPS組相比，LPS+NaHS組大鼠肺組織Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)，(P均<0.01)，LPS+NaHS組大鼠肺組織Fas蛋白表達(dá)明顯減少，(P均<0.01)；LPS+PPG組大鼠肺組織Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，

14、(P均<0.01)，LPS+PPG組大鼠肺組織Fas蛋白表達(dá)顯著增多，(P均<0.01)。PPG+LPS組大鼠mPAP>LPS組>NaHS+LPS組>對照組，NaHS組和PPG組大鼠的mPAP與對照組相比，無顯著性差異(P均>0.05)
　　 以上結(jié)果表明：H2S具有抗LPS所致的急性肺損傷的作用；并且是通過降低升高的肺動(dòng)脈壓、抗氧化、下調(diào)肺組織Fas蛋白表達(dá)、上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)來抗LPS所致的急性肺損傷。
　　 二

15、 H2S在抗LPS所致急性肺損傷時(shí)對PMN的影響
　　 方法：將112只大鼠，隨機(jī)分為4組，每組28只(其中，14只用于支氣管肺泡灌洗，另14只不行支氣管肺泡灌洗)，分別于給藥4h或8h后進(jìn)行觀察。①鹽水對照組(Control組)：氣管內(nèi)滴注無熱原生理鹽水(normal saline，NS，200μl·只-1)；②LPS組：氣管內(nèi)滴注LPS(200μg·200μl-1·只-1)；③LPS+NaHS(H2S供體)組：氣管內(nèi)滴注LP

16、S前15 min經(jīng)腹腔注射0.5ml NaHS(28μmol·kg-1)；④LPS+PPG(CSE抑制劑)組：氣管內(nèi)滴注LPS前15 min經(jīng)腹腔注射0.5ml PPG(45μmol·kg-1)。動(dòng)物模型的復(fù)制同第一部分。采用生化方法檢測肺組織髓過氧化物酶(MPO)活性；光鏡下計(jì)數(shù)BALF中PMN數(shù)目；免疫組織化學(xué)染色觀察肺組織ICAM-1蛋白表達(dá)的變化；流式細(xì)胞學(xué)方法檢測血PMN CD11b。
　　 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s

17、)表示，用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析。對PMN數(shù)量采用多樣本均數(shù)比較的秩和檢驗(yàn)及兩兩比較的秩和檢驗(yàn)，在各時(shí)間點(diǎn)所有變量的差異用單因素方差分析(one-way ANOVA)來檢驗(yàn)，先進(jìn)行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)，滿足方差齊性要求時(shí)組間比較采用LSD法，不滿足方差齊性要求時(shí)組間比較采用Dunnett's T3法。雙變量的相關(guān)分析用直線相關(guān)分析法分析。以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：在同一測定時(shí)間點(diǎn)，大鼠BALF中PMN的

18、數(shù)目，LPS+PPG組>LPS組>LPS+NaHS組>對照組相，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；血PMN CD11b與BALF中PMN計(jì)數(shù)的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，兩者存在顯著正相關(guān)(r=0.789，P<0.01)；肺組織中MPO活性也與血PMN CD11b表達(dá)的變化出現(xiàn)了同趨勢的改變。與對照組相比，LPS組大鼠肺組織中ICAM-1蛋白含量及表達(dá)均表現(xiàn)為上調(diào)；NaHS治療組大鼠肺組織中的ICAM-1蛋白含量及表達(dá)則出現(xiàn)了降低，而LPS+PPG組大鼠肺組織中

19、ICAM-1陽性信號表達(dá)較LPS治療組增多。
　　 以上結(jié)果表明：H2S對LPS誘導(dǎo)的PMN在肺組織內(nèi)聚集、黏附、激活及延遲凋亡的抑制作用是通過減少ICAM-1、CD11b、MPO活性的表達(dá)來降低PMN與血管內(nèi)皮細(xì)胞間的相互作用，從而發(fā)揮其抗氧化、抑制PMN在肺內(nèi)的大量聚集、黏附，改善了肺微血管的通透性、減少了肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)的滲出等，起到了保護(hù)肺組織的作用。
　　 結(jié)論：1、H2S具有抗LPS所致的急性肺損傷的作用。