P19細胞向心肌分化及其移植改善心肌梗死大鼠心功能的研究.pdf

1、目前在世界范圍內(nèi)，充血性心力衰竭發(fā)病率的增加已成為心臟疾病中的主要問題，而心衰的主要原因是冠心病心肌梗死。近20年來醫(yī)學界一直在不斷地改善和提高治療技術和手段。然而，現(xiàn)在的藥物療法和手術療法還存在很多不足，雖然溶栓和急診經(jīng)皮腔冠狀動脈血管成形術(PTCA)等血管重建技術，可以使急性心肌梗死的梗死區(qū)早期再灌注，減少梗死面積，保護心功能，提高患者生存率，但不能逆轉已經(jīng)壞死的心??；血管緊張素轉換酶抑制劑及β-受體阻滯劑等藥物可以使心力衰竭患者

2、的預后得以改善，但是并不能改變心肌細胞數(shù)量減少；心臟移植雖然可以替代受損心臟，但因供體有限，難以廣泛推廣應用。近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，利用細胞移植方法來修復受損心臟，對心肌進行重建治療，改善心功能已成為可能。這一療法對充血性心力衰竭的治療具有重要意義，并有巨大的發(fā)展前途。目前對該療法研究的焦點問題是：(1)細胞的選擇。選擇適宜的移植細胞類型至關重要，哪一種細胞效果更好，目前還缺乏系統(tǒng)的研究。(2)用于移植的動物模型。目前所用的動物

3、心肌缺血模型多通過對其心肌冷凍損傷、冠狀動脈結扎或栓塞，其在一定程度上模擬心肌梗死，但與臨床冠心病的病理改變還不盡相同，更接近動脈硬化的心肌梗死模型還有待進一步探討。(3)植入的細胞生存和繼續(xù)增殖多長時間，在完全分化后是否還會行使功能。(4)臨床研究中的移植細胞示蹤和分化鑒定問題。動物實驗中應用的標記物對供體細胞和受體都有一定的毒性，必須找到對人體無害又便于跟蹤的標記物。(5)移植細胞的合適數(shù)量目前尚難確定，因為各種細胞的增殖分化能力不

4、同。干細胞源性心肌細胞移植治療心肌梗死，是未來治療心肌梗死和心力衰竭的策略和方向。但是，這一方法要應用于臨床還很遙遠，臨床應用之前還應全面了解干細胞的生物學特性，分化機制和條件，以及干細胞如何在梗死疤痕組織中分化和再生成心肌細胞，再生的心肌細胞如何才能與移植存活的心肌發(fā)生功能上的整合，如興奮收縮耦聯(lián)和機械收縮的協(xié)調(diào)一致，從而在功能上代替丟失的心肌細胞，如何才能誘導轉錄因子的表達，從而促進干細胞的在體分化等諸多問題。P19胚性癌細胞是加拿

5、大渥太華大學McBerney等在1982年從雄性小鼠畸胎瘤中分離得到的，是一種能在體外培養(yǎng)增殖、分化的多能干細胞，在一定濃度二甲基亞砜(DMSO)的誘導下，可以向心肌細胞分化。P19細胞是一種具有類似于胚胎干細胞的特性而又優(yōu)于胚胎干細胞的細胞：第一，它來源于動物畸胎瘤，不涉及倫理問題；第二，它是一個穩(wěn)定的細胞系，實驗室中容易獲得；第三，它具有正常小鼠二倍體核型，細胞分裂快，可在體外迅速大量擴增，多次傳代也不喪失其分化能力，易于得到移植所

6、需的細胞數(shù)量；第四，因其為胚胎來源，免疫原性較弱。基于以上特點，本研究對P19細細胞在體外和體內(nèi)向心肌分化進行觀察，并選用P19細胞作為移植細胞觀察移植到冷凍損傷的大鼠心肌疤痕組織后，其心功能的改善情況。本實驗共分三個部分。 方法與結果1DMSO體外誘導P19細細胞向心肌樣細胞分化 將P19細胞在體外DMSO誘導條件下向心肌樣細胞分化。P19細胞經(jīng)復蘇、傳代，用含5％、10％、15％3種不同濃度胎牛血清的培養(yǎng)液，同時進行

7、培養(yǎng)，觀察哪一種濃度胎牛血清對P19細胞聚集體形成更好。P19細胞經(jīng)復蘇、傳代，在體外用1％DMSO誘導其向心肌細胞分化。分化的P19細胞經(jīng)HE染色及心肌標志物GATA-4、Connecxin43、α-sarcomericactin的免疫細胞化學染色后，在光鏡、倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學變化。透射電鏡下觀察細胞超微結構變化。結果表明：(1)3種不同濃度胎牛血清的培養(yǎng)液對細胞聚集體形成率的比較：含15％和10％胎牛血清培養(yǎng)液細胞聚集體形成

8、率比含5％胎牛血清的培養(yǎng)液高，差異顯著(P＜0.05)。含10％胎牛血清的培養(yǎng)液和含15％胎牛血清的培養(yǎng)液對細胞聚集體形成率比較，差異無顯著性(p＞0.05)。(2)經(jīng)DMSO誘導分化后4d有細胞聚集體形成，6d有部分細胞GATA-4和Connecxin43呈陽性表達，GATA-4陽性表達位于細胞核和細胞質，Connecxin43陽性表達呈斑點狀分布于心肌細胞細胞質內(nèi)和細胞膜表面。10d時GATA-4和Connecxin43陽性表達明顯

9、增加，并有部分細胞呈α-sarcomericactin陽性，陽性表達位于細胞質。電鏡觀察，未分化細胞細胞體小，細細胞質較少，細胞間連接松散，細胞器不發(fā)達；誘導后6d，細胞間出現(xiàn)緊密連接和中間連接，細細胞質增多，部分細胞表面出現(xiàn)突起，突起內(nèi)可見微絲。誘導后10d，線粒體、粗面內(nèi)質網(wǎng)、滑面內(nèi)質網(wǎng)、高爾基復合體豐富，并有肌絲形成。以上表明P19細胞在DMSO誘導下已有向心肌分化趨向，有類似胚胎心肌細胞形成。 2P19細胞在體內(nèi)心肌環(huán)境

10、中向心肌細胞分化 將P19細胞移植入大鼠心肌梗死心肌內(nèi)，觀察其分化情況。P19細胞復蘇、傳代后，通過局部注射將其移植入大鼠梗死心肌，分別于移植后4周、8周，通過心肌標志物—心肌特異性轉錄因子GATA-4、連接蛋白43(Connecxin43)、α-肌節(jié)型肌動蛋白(α-sarcomericactin)的免疫細胞化學染色觀察細胞形態(tài)學變化。結果顯示：(1)細胞移植區(qū)有GATA-4表達陽性的細胞，棕色陽性顆粒表達于細胞質及細胞核，在移

11、植4周，移植部位有較少的GATA-4陽性細胞，在移植后8周，陽性細胞數(shù)量較多。(2)移植后4周，移植細胞未見α-sarcomericactin陽性表達。移植后8周，在位于移植區(qū)與正常心肌交界處的部分移植細胞胞質中α-sarcomericactin表達陽性。(3)移植后4周，移植細胞未見connexin43陽性表達，移植后8周，在位于移植區(qū)與正常心肌交界處的部分移植細胞胞質中，connexin43表達陽性。此結果表明P19細胞在體內(nèi)心肌環(huán)

12、境中可向心肌樣細胞分化。3P19細胞移植改善心肌梗死大鼠心功能 觀察P19細胞移植入大鼠梗死心肌后其存活情況及對大鼠心功能的影響。方法：正常雄性SD大鼠30只，隨機分成移植組(n=20)和對照組(n=10)，用液氮冷凍方法，建立大鼠心肌梗死模型，大鼠心肌梗死后立即將復蘇后培養(yǎng)4～5代的P19細胞以4×106個/ml通過局部注射方法移植入心肌梗死區(qū)及周邊區(qū)，對照組注射等量的培養(yǎng)液。8周后觀察植入細胞的存活情況，并通過血流動力學各項

13、指標評價P19細胞移植對大鼠心功能的改善情況。結果：大鼠心肌梗死模型成功率80％。HE染色顯示移植細胞存活者6例，作為統(tǒng)計范圍。移植組左心室收縮壓(LVSP)、左心室等容期壓力最大變化速率(±dp/dtmax)明顯高于對照組(P＜0.01)，左心室舒張末期壓(LVEDP)明顯低于對照組(P＜0.01)。移植組有1例檢測心功能時發(fā)現(xiàn)有偶發(fā)室性早搏。結論：P19細胞移植入大鼠心肌梗死區(qū)后能夠存活，并明顯改善心肌梗死后大鼠的心功能；P19細胞

14、可以作為研究心肌梗死細胞移植療法的模型細胞。 結論1含10％胎牛血清和15％胎牛血清培養(yǎng)液中P19細胞的細胞聚集體形成率比含5％胎牛血清的培養(yǎng)液高，差異顯著；含10％胎牛血清與含15％胎牛血清的培養(yǎng)液中，P19細胞聚集體形成率比較無顯著差異。 2P19細胞在DMSO誘導下，心肌標志物GATA-4，α-sarcomericactin，Connecxin43表達陽性，超微結構變化顯示細胞出現(xiàn)緊密連接和中間連接，并有肌絲形成，

15、表明細胞向心肌方向分化，有類似胚胎心肌細胞形成。 3P19細胞移植到大鼠梗死心肌后，隨著移植時間的延長，能夠增殖分化，表達心肌標志物GATA-4、α-sarcomericactin及Connexin43，表明P19細胞在大鼠體內(nèi)心肌環(huán)境中可以向心肌樣細胞分化。 4用液氮冷凍方法可以造成大鼠心肌梗死模型，模型成功率為80％。5大鼠梗死心肌經(jīng)P19細胞移植治療，心功能血流動力學檢測顯示，與z 對照組相比，移植組LVS