基于引經理論探討麝香促進骨髓間充質干細胞遷移的信號通路研究.pdf

1、目的：通過麝香含藥血清干預骨髓間充質干細胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs），擬從信號通路入手進行研究，探討信號通路與干細胞遷移學說及中醫(yī)引經理論的相關性，為研究引經藥提供了新思路，為其遷移機制提供理論依據(jù)。
　　方法：通過給大鼠灌服高、中、低劑量的麝香并制備不同濃度含藥血清，以灌服等體積生理鹽水制備的血清作為空白對照組。采用貼壁篩選法體外培養(yǎng)大鼠BMSCs，培養(yǎng)至第三代，用流式細胞儀檢測細胞表

2、面抗原，經過成骨成脂誘導鑒定認為培養(yǎng)BMSCs成功后，利用制備的不同濃度麝香含藥血清的5％濃度含藥血清干預第三代BMSCs，利用MTT法檢測BMSCs增殖情況，成骨誘導后進行堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）定性、定量檢測，I-型膠原免疫熒光染色，測定鈣化結節(jié)數(shù)。通過加入不同信號通路阻斷劑利用Transwell小室檢測BMSCs細胞遷移率變化，比較不同時間段各組間、組內差異，進行統(tǒng)計學分析，從而探討不同濃度麝

3、香對大鼠BMSCs增殖、成骨分化等的影響，同時探討不同濃度麝香介導信號通路對BMSCs遷移影響。
　　結果：采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)的大鼠BMSCs呈梭形或旋渦狀，貼壁生長，生長狀態(tài)良好、純度較高、活力較好；表型鑒定結果顯示P3代BMSCs中CD45和CD34為陰性抗原，CD44和CD90為陽性抗原；加入成骨、成脂誘導劑后，BMSCs可定向成骨、成脂分化；MTT結果表明，與對照組比較，第1天中濃度麝香組促進BMSCs增殖顯著（P＜

4、0.05），其余各時間段以低濃度麝香組促進BMSCs增殖作用最強（P＜0.05），不同時間段組內比較無差異（P＞0.05）；不同濃度組麝香在不同時間段均能促進BMSCs成骨性分化，具體有：（1）與對照組比較，各誘導組在不同時間段均能提高ALP活性及染色陽性數(shù)(P＜0.05)，以低濃度組影響較顯著（P＜0.01），不同時間段組內比較無差異(P＞0.05)；（2）與對照組比較，不同濃度麝香組鈣化結節(jié)數(shù)目顯著增加(P＜0.05)，以低濃度麝香

5、組顯著（P＜0.01）；（3）與對照組比較，不同濃度麝香組對Ⅰ-型膠原陽性表達明顯提高(P＜0.05)，以低濃度麝香組顯著（P＜0.01）；在Transwell遷移實驗結果顯示：（1）與對照組比較，不同濃度麝香在24h、48h、72h均增加BMSCs遷移（P＜0.05），麝香促BMSCs遷移效應與濃度呈負相關、與時間呈正相關，以低濃度組效果最好（P＜0.01），不同時間段組內比較無差異（P＞0.05）；（2）加入阻斷劑PD98059后顯

6、示，與對照組比較，低濃度麝香組在不同時間段增加BMSCs遷移數(shù)量（P＜0.05），低濃度麝香組+PD干預組隨著時間延長其遷移數(shù)量明顯減少，不同時間段組內比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；（3）加入阻斷劑GF109203X后顯示，與對照組比較，低濃度麝香組在24h、48h、72h促BMSCs遷移數(shù)量明顯增加（P＜0.05），低濃度麝香組+GF干預組其遷移數(shù)量不同時間段明顯減少，不同時間段組內比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；（4）加

7、入阻斷劑LY294002后顯示，與對照組比較，低濃度麝香組促BMSCs遷移數(shù)量隨時間延長而增加（P＜0.05），低濃度麝香組+LY干預組其遷移數(shù)量與時間呈負相關。說明麝香促BMSCs遷移的機制與活化MAPK/ERK1/2、PKC、PI3K/AKT信號通路有關。
　　結論：麝香可促進BMSCs增殖，并參與成骨分化過程；麝香可促進外源性BMSCs遷移，其機制可能與MAPK/ERK1/2、PI3K/AKT及PKC通路活化有關，該途徑對麝