家蠶過(guò)剩半月紋退化腹肢突變(Edl)的精細(xì)定位及相關(guān)調(diào)控元件鑒定.pdf

1、昆蟲為了生存和繁衍演化出多樣性的附肢，從發(fā)育生物學(xué)角度來(lái)看主要是進(jìn)化過(guò)程中基因差異表達(dá)和功能變化的結(jié)果。附肢的發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，由多層次的基因網(wǎng)絡(luò)級(jí)聯(lián)調(diào)控形成。同源異型基因（Homeotic gene,Hox）是首先在果蠅中發(fā)現(xiàn)的，是昆蟲軀體模式發(fā)育的主要調(diào)控基因；Hox基因在基因組上成簇排列，按其在基因組上排列的順序從3’到5’依次表達(dá)，分別決定軀體從前到后不同體節(jié)的特征，特別是附肢發(fā)育部位和形態(tài)等特征，對(duì)研究附肢發(fā)育和分化有

2、重要的意義。在昆蟲中對(duì)Hox基因功能的研究已經(jīng)有一定基礎(chǔ)，研究發(fā)現(xiàn)由于不同物種中Hox基因功能在進(jìn)化上差異分化生成各式各樣的附肢。Hox基因的表達(dá)受到精確的調(diào)控，在果蠅BX-C基因簇中已鑒定分析發(fā)現(xiàn)大量的順式調(diào)控元件和非編碼RNA（Non-coding RNA,ncRNA）調(diào)控Hox基因的精確表達(dá)；而在其他昆蟲中Hox基因的表達(dá)調(diào)控研究，特別是Hox基因簇中功能元件對(duì)Hox基因調(diào)控的研究仍然匱乏。
　　家蠶是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲，擁有完

3、整的基因組數(shù)據(jù)和精細(xì)的遺傳變異圖譜，也是鱗翅目基礎(chǔ)生物學(xué)研究的重要模式。家蠶保存有大量Hox基因座位的突變，如E擬復(fù)等位基因群（E群），是研究鱗翅目Hox基因功能和表達(dá)調(diào)控的良好材料。家蠶E群位點(diǎn)有3個(gè)Hox基因，涉及30多個(gè)突變體，本研究選取E群過(guò)剩半月紋退化腹肢突變（extra-crescents and degenerated abdominal legs mutant,Edl）作為研究材料，通過(guò)定位克隆、表達(dá)分析及免疫組化等手段

4、探究Hox基因?qū)dl突變形成的作用機(jī)制；并且利用生物信息學(xué)、表達(dá)關(guān)聯(lián)分析及RNAi等方法對(duì)定位區(qū)間存在的功能元件進(jìn)行鑒定和功能研究，分析功能元件與Hox基因之間可能的作用關(guān)系。本論文所得主要結(jié)果如下：
　　1.家蠶Edl突變的形態(tài)特征觀察和遺傳分析
　　家蠶Edl突變位于家蠶第6連鎖群21.1位點(diǎn)，是E群突變之一，其經(jīng)典表型特征描述為：幼蟲第3腹節(jié)背面有過(guò)剩半月紋，無(wú)星紋，第1腹足退化，顯性突變。觀察其表型特征為：幼蟲第3

5、腹節(jié)背面有一對(duì)過(guò)剩半月紋，第5腹節(jié)有星紋，同時(shí)腹面的第一對(duì)腹足退化，腹足遠(yuǎn)端的爪鉤缺失，此外個(gè)別個(gè)體背部2、3腹節(jié)半月紋處出現(xiàn)環(huán)節(jié)愈合現(xiàn)象。遺傳分析顯示大造（正常型）與Edl雜交得F1為正常型，F(xiàn)1自交產(chǎn)生的F2會(huì)分離出正常型和Edl突變表型，且分離比為3:1；F1個(gè)體與正常型正反測(cè)交得到的后代均為正常型，F(xiàn)1個(gè)體與Edl正反測(cè)交，得到的后代Edl突變性狀和正常型分離比1:1。通過(guò)雜交和回交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Edl突變?yōu)殡[性突變，利用家蠶雌完全連

6、鎖的特性，對(duì)大造和Edl突變進(jìn)行雜交，再和Edl突變測(cè)交，配制連鎖定位群體。根據(jù)家蠶E群ECs-l和EKp-1突變的定位區(qū)域直接設(shè)計(jì)marker，利用386個(gè)BC1M個(gè)體對(duì)Edl突變進(jìn)行定位，Edl突變位點(diǎn)被定位在marker SD02和SD04之間，與marker SD03緊密連鎖，區(qū)間包含Bmabd-A。我們發(fā)現(xiàn)Edl突變是E群變中目前發(fā)現(xiàn)的唯一隱性突變。
　　2.Edl突變的精細(xì)定位和分子解析
　　擴(kuò)大群體到1205個(gè)

7、BC1M個(gè)體并加密標(biāo)記，對(duì)Edl突變進(jìn)行精細(xì)定位。Edl突變位點(diǎn)被定位到marker D4和D6之間約211 Kb的區(qū)域，此區(qū)域?yàn)镠ox基因Bmabd-A和Bmabd-B之間的一段無(wú)預(yù)測(cè)基因的間區(qū)，分別位于Bmabd-A上游，Bmabd-B下游，距Bmabd-A約10Kb，Bmabd-B約100Kb。Edl突變第三腹節(jié)腹足退化，在該環(huán)節(jié)主要表達(dá)的是Bmabd-A基因，且是家蠶腹足發(fā)育的必須基因，因此我們?cè)诩倚Q胚胎腹足發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期戊3期

8、（胚胎發(fā)育第20個(gè)階段）調(diào)查Bmabd-A的表達(dá)，結(jié)果表明在該時(shí)期對(duì)腹足發(fā)育有重要作用的Bmabd-A表達(dá)水平降低。Hox基因簇中相鄰基因間能相互調(diào)控，且基因組上排列靠后的Hox基因能抑制靠前基因的表達(dá)。我們調(diào)查Bmabd-A鄰近Hox基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在基因組上分別位于Bmabd-A前后的BmUbx和Bmabd-B表達(dá)都明顯升高。同時(shí)我們通過(guò)免疫熒光技術(shù)，調(diào)查了腹足遠(yuǎn)端發(fā)育基因BmDll的表達(dá)情況，在大造和Edl突變正常發(fā)育附肢原基頂端

9、都能檢測(cè)到BmDll的表達(dá)，而在Edl突變退化的腹足原基處BmDll的表達(dá)缺失，這與Edl突變?nèi)笔Ц棺氵h(yuǎn)端的表型相符。我們推測(cè)在Edl突變中Bmabd-A的表達(dá)降低，繼而改變腹足遠(yuǎn)端基因BmDll的表達(dá)，使突變中出現(xiàn)退化腹足的表型。
　　3.Edl突變定位區(qū)間miRNA和順式調(diào)控元件分析
　　家蠶E位點(diǎn)與果蠅BX-C區(qū)域的序列同源，在果蠅同源的區(qū)域中有大量的順式調(diào)控元件和miRNA對(duì)鄰近的Hox基因有調(diào)控作用。本部分我們分析

10、了Edl定位區(qū)間miRNA胚胎期的表達(dá)模式及其與Hox基因表達(dá)的相關(guān)性；預(yù)測(cè)和鑒定Edl定位區(qū)間的CTCF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件，并對(duì)其在家蠶中保守性和在Edl突變及多品系中差異性進(jìn)行分析。Edl定位區(qū)間中有miR-iab-4和miR-2835兩個(gè)miRNA位點(diǎn)，其中miR-iab-4位點(diǎn)能形成miR-iab-4-3p，miR-iab-4-5p和miR-iab-8三個(gè)miRNA。首先通過(guò)克隆分析發(fā)現(xiàn)兩個(gè)miRNA基因組上的pre-miRNA序

11、列在Edl和野生型中沒有任何差異。然后我們利用不同的軟件預(yù)測(cè)miRNA在BmUbx和Bmabd-A mRNA序列上的靶位點(diǎn)。RNAhybrid軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-iab-4-3p在BmUbx和Bmabd-A序列上分別有4和5個(gè)靶位點(diǎn)；miR-iab-4-5p在BmUbx序列上有4個(gè)靶位點(diǎn)而在Bmabd-A序列上沒有靶位點(diǎn)；miR-iab-8在BmUbx和Bmabd-A序列上都只有1個(gè)靶位點(diǎn)；miR-2835在BmUbx和Bmabd-A序

12、列上分別有4和1個(gè)靶位點(diǎn)。利用miRnada軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)所有的miRNA在BmUbx上都沒有作用位點(diǎn)，而miR-iab-4-3p，miR-iab-8和miR-2835在Bmabd-A上分別有1，2，1個(gè)靶位點(diǎn)。利用PITA軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)只有miR-iab-8在BmUbx上有1個(gè)靶位點(diǎn)，其他miRNA在BmUbx上沒有靶位點(diǎn)；miR-iab-4-3p，miR-iab-4-5p，miR-iab-8和miR-2835在Bmabd-A上分別有2，

13、1，4，3個(gè)靶位點(diǎn)。值得注意的是，miRnada和PITA軟件預(yù)測(cè)的miR-iab-8和miR-2835在Bmabd-A序列上有部分重疊的靶位點(diǎn)，而沒有發(fā)現(xiàn)有三個(gè)軟件共同預(yù)測(cè)的靶位點(diǎn)。由于家蠶腹足在胚胎期就已經(jīng)形成，我們對(duì)miR-iab-4-3p，miR-iab-4-5p，miR-2835，BmUbx和Bmabd-A在大造胚胎期的表達(dá)模式進(jìn)行檢測(cè)，并計(jì)算這三個(gè)miRNA和BmUbx，Bmabd-A表達(dá)之間的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BmUbx和B

14、mabd-A的表達(dá)與這三個(gè)miRNA的表達(dá)沒有相關(guān)性。
　　CTCF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)是Hox基因簇中重要的順式調(diào)控元件，對(duì)Hox基因的精確時(shí)空表達(dá)有重要調(diào)節(jié)作用。對(duì)Edl突變定位區(qū)間的CTCF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行鑒定分析，發(fā)現(xiàn)共有8個(gè)CTCF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。瓊脂糖凝膠檢測(cè)發(fā)現(xiàn)只有2位點(diǎn)的序列有多態(tài)性，多品系分析發(fā)現(xiàn)多態(tài)性并不特異。對(duì)結(jié)合位點(diǎn)及其前后各50bp的序列在家蠶和野蠶多品系中進(jìn)行保守性分析，發(fā)現(xiàn)2、6、7、8位點(diǎn)序列保守

15、，其他位點(diǎn)不保守。對(duì)Edl定位區(qū)間CTCF結(jié)合位點(diǎn)序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，在Edl突變中只有1和3位點(diǎn)與Dazao有差異，且多品系比對(duì)發(fā)現(xiàn)是非Edl品系特異性差異。多品系分析發(fā)現(xiàn)2、6、7、8位點(diǎn)最保守，在所有的品系中都沒有差異；1、5位點(diǎn)序列中有少量非品系特異差異；3、4位點(diǎn)有品系特異的差異。對(duì)定位區(qū)間不保守的1、3、4、5位點(diǎn)的變異序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)只有4位點(diǎn)第13個(gè)位置的序列由G變?yōu)锳會(huì)導(dǎo)致4位點(diǎn)失去活性，其他變異并不影響位點(diǎn)的CTCF

16、蛋白結(jié)合活性；4位點(diǎn)和5位點(diǎn)在鄰近基因組位點(diǎn)，且4位點(diǎn)和5位點(diǎn)序列在檢測(cè)的品系中不同時(shí)發(fā)生變異，保持該基因組區(qū)域CTCF蛋白結(jié)合調(diào)控的能力。綜上Edl突變定位區(qū)間除了結(jié)合位點(diǎn)4的所有CTCF結(jié)合位點(diǎn)與CTCF蛋白結(jié)合能力都是保守的，所有結(jié)合位點(diǎn)所在的基因組位點(diǎn)與CTCF蛋白結(jié)合能力均保守。
　　4.Edl突變定位區(qū)間lncRNA分析
　　我們?cè)贐mabd-A和Bmabd-B基因間區(qū)發(fā)現(xiàn)一個(gè)新轉(zhuǎn)錄本，通過(guò)Race技術(shù)獲得全長(zhǎng)，

17、ORF預(yù)測(cè)和分析發(fā)現(xiàn)其ORF小于300個(gè)堿基且無(wú)保守的結(jié)構(gòu)域，鑒定為一個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA,lncRNA），并命名為lncRNA-iab1。lncRNA-iab1具有多種剪接體，根據(jù)剪接體3’端在基因組上不同的位置可以分為兩類type1和type2。利用LncTar軟件預(yù)測(cè)lncRNA-iab1與BmUbx、Bmabd-A和Bmabd-B可能的相互作用，發(fā)現(xiàn)lncRNA-iab1的各類剪接體都不能直

18、接與BmUbx、Bmabd-A和Bmabd-B相互作用。利用RNAhybrid、miRnada和PITA三個(gè)不同的軟件對(duì)miRNA在lncRNA-iab1轉(zhuǎn)錄本上的作用位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，miRnada軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)只有miR-iab-4-5p和miR-iab-4-3p在lncRNA-iab1轉(zhuǎn)錄本type2剪接體上分別有1個(gè)作用位點(diǎn)；RNAhybrid軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-iab-4-5p、miR-iab-4-3p和miR-2835在lncRN

19、A-iab1轉(zhuǎn)錄本上分別有1、1、2個(gè)作用位點(diǎn)，miR-iab-8在lncRNA-iab1轉(zhuǎn)錄本上沒有作用位點(diǎn)，且除了miR-2835有一個(gè)位點(diǎn)只在type2剪接體存在，其他所有位點(diǎn)在各類剪接體都存在；PITA軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-iab-4-3p和miR-iab-8在lncRNA-iab1轉(zhuǎn)錄本type2剪接體上分別有2個(gè)作用位點(diǎn)。綜上我們發(fā)現(xiàn)miRNA與lncRNA-iab1可能有相互作用。
　　通過(guò)胚胎期表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)lncR

20、NA-iab1與其內(nèi)含子區(qū)域的3個(gè)miRNA基因miR-iab-4-3p，miR-iab-4-5p和miR-2835的表達(dá)沒有相關(guān)性；lncRNA-iab1與Bmabd-A和Bmabd-B的表達(dá)模式在胚胎期和幼蟲期存在很強(qiáng)的相關(guān)性，在變態(tài)發(fā)育期它們表達(dá)模式之間的相關(guān)性降低；lncRNA-iab1與 BmUbx的表達(dá)模式只在胚胎期有很強(qiáng)的相關(guān)性。4齡將眠組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA-iab1在神經(jīng)和表皮中有特異性高表達(dá)，其中表皮中表達(dá)最

21、高；對(duì)表皮進(jìn)行分段檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，lncRNA-iab1沿體軸從前往后表達(dá)量逐漸升高，第7-10腹節(jié)表達(dá)最高。為了探討lncRNA-iab1的功能，在4齡2天對(duì)lncRNA-iab1進(jìn)行RNAi處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干涉?zhèn)€體大量致死（死亡個(gè)體和總注射個(gè)體的比例13/14，12/12），而干涉對(duì)照個(gè)體基本無(wú)影響（死亡個(gè)體和總注射個(gè)體的比例1/12），進(jìn)一步通過(guò)分子檢測(cè)發(fā)現(xiàn)lncRNA-iab1干涉?zhèn)€體中l(wèi)ncRNA-iab1的表達(dá)顯著降低。調(diào)查干涉組中

22、相關(guān)Hox基因Bmabd-A和Bmabd-B的表達(dá)，結(jié)果顯示并無(wú)顯著性變化。我們推測(cè)lncRNA-iab1與 Hox基因的表達(dá)相關(guān)性可能與lncRNA-iab1的生產(chǎn)過(guò)程相關(guān)，即其成熟的轉(zhuǎn)錄本不影響Hox基因的表達(dá)水平；其轉(zhuǎn)錄本可能參與其他生理上的功能，對(duì)家蠶的存活有重要的影響。
　　在Edl突變中只檢測(cè)到lncRNA-iab1的type2類剪接體，type2部分剪接體的3’末端與Dazao比有差異，且缺少了type2類剪接體中與

23、Bmabd-A重疊的剪切形式。在Dazao和Edl突變腹足發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期（戊3期）lncRNA-iab1的總轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有差異；而Edl突變中l(wèi)ncRNA-iab1只有type2類剪接體，比較Dazao和Edl突變中type2類剪接體表達(dá)水平，即Dazao中type2類剪接體和Edl突變中總轉(zhuǎn)錄水平發(fā)現(xiàn)，Edl突變中type2類剪接體轉(zhuǎn)錄水平顯著比Dazao中要高。lncRNA-iab1中type2類剪接體轉(zhuǎn)錄覆蓋的基因組區(qū)域遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于typ