IL-8-CXCL8及其受體拮抗劑G31P對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響及相關(guān)分子機(jī)制研究.pdf

1、背景:動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是一種與脂質(zhì)代謝障礙有關(guān)的，以大、中動(dòng)脈內(nèi)膜脂質(zhì)沉著、粥樣斑塊形成、管壁硬化為特征的全身性疾病。動(dòng)脈粥樣硬化是許多心腦血管疾病的重要病理基礎(chǔ)，給人類(lèi)的健康造成了極大地危害。但AS的發(fā)病機(jī)制至今尚未明確。近年，炎癥學(xué)說(shuō)的提出和建立為AS的研究指明了方向。該學(xué)說(shuō)認(rèn)為“動(dòng)脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病”，其發(fā)生和發(fā)展伴隨炎癥反應(yīng)。
　　白細(xì)胞介素-8(Interleukin-8，IL

2、-8)又稱(chēng)趨化因子8(C-X-Cmotifligand8，CXCL8)，是趨化因子超家族中的一員，與炎癥性疾病密切相關(guān)。研究已經(jīng)證明IL-8/CXCL8等趨化因子及其特異性受體在動(dòng)脈粥樣硬化中超重要作用。除單核巨噬細(xì)胞外，血管內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞也能產(chǎn)生IL-8/CXCL8，而血管平滑肌細(xì)胞(vascularsmoothmusclecell，VSMC)的增殖和遷移，是形成動(dòng)脈粥樣硬化的重要環(huán)節(jié)之一。關(guān)于IL-8/CXCL8對(duì)血管平滑

3、肌細(xì)胞的趨化作用的分子機(jī)制，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。
　　CXCL8(3-72)-K11R/G31P(簡(jiǎn)稱(chēng)G31P)為采用基因點(diǎn)突變制備的人IL-8/CXCL8突變體，研究已經(jīng)證實(shí)它具有高親和力的結(jié)合CXCR1/CXCR2，但無(wú)生物學(xué)活性，與IL-8/CXCL8競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CXCR1/CXCR2，故被認(rèn)為是IL-8/CXCL8拮抗劑。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)G31P在肺血管病變、前列腺癌等炎癥性疾病中發(fā)揮著重要的抗炎作用，使疾病向有利的方向發(fā)

4、展。那么，G31P在高脂血癥和動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型中是否可以降低炎癥反應(yīng)，是否可以抑制血管平滑肌細(xì)胞向血管內(nèi)膜的增殖和遷移，從而達(dá)到延緩和控制高脂血癥和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展？IL-8/CXCL8在體外培養(yǎng)的大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中是否具有一定的趨化作用，G31P是否具有一定的抑制效果呢？這些都是本實(shí)驗(yàn)所關(guān)注的研究?jī)?nèi)容。
　　目的:
　　1、通過(guò)建立高脂血癥小鼠模型，探討IL-8/CXCL8在高脂血癥小鼠體內(nèi)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)（TN

5、F-α、γ-IFN）以及對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移(mef2a、PCNA、MMP-2、MMP-9)的影響，并觀察G31P是否可以抑制高脂血癥小鼠炎癥反應(yīng)及血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。
　　2、通過(guò)建立動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型，探討IL-8/CXCL8在動(dòng)脈粥樣硬化小鼠模型中通過(guò)CXCR2調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)(TNF-α、γ-1FN)以及對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移(mef2a、PCNA、MMP-2、MMP-9)的影響，并觀察G31P是否可以抑制

6、動(dòng)脈粥樣硬化小鼠炎癥反應(yīng)及抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。
　　3、探討IL-8/CXCL8對(duì)體外培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞(A7r5)增殖和遷移的影響，并檢測(cè)G31P是否可抑制IL-8/CXCL8誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。
　　4、初步探討G31P抑制IL-8/CXCL8誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞(A7r5)增殖、遷移的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
　　方法:
　　1、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)部分:(1)高脂血癥動(dòng)物模型的建立:30只雄性BAL

7、B/c小鼠隨機(jī)分為二組:對(duì)照組（control，標(biāo)準(zhǔn)飲食，皮下注射生理鹽水），高脂血癥模型組（H.F.D，高脂飲食，皮下注射生理鹽水）和G31P處理組（G31P，高脂飲食，皮下注射G31P），喂養(yǎng)8個(gè)月后，測(cè)定血脂等生化指標(biāo)確定高脂血癥模型是否建立成功。(2)動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型的建立:20只雄性APOE-/-小、鼠隨機(jī)分為二組:動(dòng)脈粥樣硬化模型組（AS，皮下注射生理鹽水）和G31P處理組（G31P，皮下注射G31P）。對(duì)照組為其野生型

8、C57BL/6J小鼠（control，標(biāo)準(zhǔn)飲食，皮下注射生理鹽水）。AS和G31P處理組均予高脂飼料喂養(yǎng)12周，觀察主動(dòng)脈病理學(xué)改變確定動(dòng)脈粥樣硬化模型是否建立成功。(3)采用ELISA方法檢測(cè)動(dòng)物血清中IL-8/CXCL8的含量。(4)使用生化學(xué)方法檢測(cè)血清中CHO、TG、LDL-C和HDL-C的動(dòng)態(tài)改變。(5)采用RT-PCR和免疫組化方法檢測(cè)主動(dòng)脈血管中KC、CXCR2、TNF-α、γ-IFN、MMP-2、MMP-9、PCNA和m

9、ef2a等細(xì)胞因子的表達(dá)。
　　2、體外實(shí)驗(yàn)部分:(1)運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)體外培養(yǎng)的大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞(A7r5)中IL-8/CXCL8受體的表達(dá);(2)MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)研究IL-8/CXCL8誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞的增殖以及G31P的抑制作用;(3)細(xì)胞劃痕法和Bordernchamber法測(cè)定IL-8/CXCL8誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞的遷移以及G31P的抑制作用;(4)采用免疫蛋白印跡技術(shù)，檢測(cè)IL-8/CXCL8與MAPK

10、途徑中ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的相關(guān)性，以及G31P抑制ERK通路的級(jí)聯(lián)活化。
　　結(jié)果:
　　1、第一部分實(shí)驗(yàn):(1)體重:實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，H.F.D組與control組相比體重增長(zhǎng)差異顯著(p＜0.01)。G31P處理組小鼠體重的增長(zhǎng)速度要低于H.F.D組(p＜0.01)。(2)血脂:每隔2個(gè)月于小鼠眼眶取血，收集血清檢測(cè)血脂變化，H.F.D組小鼠血清中CHO、TG、LDL-C均顯著高于control組，而HDL-C低于contr

11、ol組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，符合高脂血癥診斷標(biāo)準(zhǔn)。G31P處理組，血清中CHO、TG、LDL-C含量明顯降低，同時(shí)HDL-C含量升高(p＜0.01)，說(shuō)明G31P具有一定程度的降低血脂的作用。(3)病理學(xué)改變:高脂飲食誘導(dǎo)8個(gè)月后，光鏡下小鼠主動(dòng)脈血管中未見(jiàn)泡沫細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)增殖和遷移。電鏡下，H.F.D組小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞處發(fā)現(xiàn)有平滑肌細(xì)胞，此遷移至內(nèi)膜處的平滑肌細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)吞噬的大小不一的脂肪細(xì)胞，說(shuō)明高脂飲食誘導(dǎo)8個(gè)月

12、后，已經(jīng)出現(xiàn)血管平滑肌細(xì)胞的遷移，并逐漸向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化，證明該動(dòng)物模型已進(jìn)入動(dòng)脈粥樣硬化病變的早期階段。(4)KC含量:H.F.D組血清中KC含量顯著增加，G31P組小鼠KC含量下降明顯，與H.F.D組相比差異顯著(p＜0.01)。(5)RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，H.F.D組小鼠主動(dòng)脈組織中KC、CXCR2、TNF-α、γ-IFN、mef2a表達(dá)量增高，與control組比較差異顯著。G31P處理組上述各指標(biāo)表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

13、(p＜0.01)。(6)免疫組化法檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈組織中MMP-2、MMP-9、PCNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)G31P可顯著抑制高脂血癥誘導(dǎo)的上述各因子的表達(dá)，差異顯著(p＜0.01)。
　　2、第二部分實(shí)驗(yàn):(1)血脂:小鼠高脂飲食喂養(yǎng)12周后，眼球取血，收集血清檢測(cè)血脂，AS組小鼠血清中CHO、TG、LDL-C均顯著高于control組，而HDL-C低于control組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，符合高脂血癥診斷標(biāo)準(zhǔn)。G31P處理組

14、，血清中CHO、LDL-C含量明顯降低，同時(shí)HDL-C含量升高(p＜0.01)。(2)病理學(xué)觀察:光鏡下AS和G31P組小鼠均可見(jiàn)內(nèi)膜明顯增厚，有斑塊形成，斑塊表層是一層纖維帽，部分可見(jiàn)破裂，下方可見(jiàn)大量泡沫細(xì)胞，膽固醇結(jié)晶以及大量無(wú)定形壞死物，管腔狹窄明顯，說(shuō)明動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型建立成功。主動(dòng)脈根部，AS組與G31P組PA/LA比值無(wú)顯著性差異。心臟冠狀動(dòng)脈G31P處理組斑塊面積明顯減少，而AS組管腔狹窄明顯，兩者有顯著性差異（p＜

15、0.01）。(3)ELISA法檢測(cè)小鼠血清中KC的含量，發(fā)現(xiàn)AS組血清中KC含量顯著增加，G31P組小鼠KC含量下降明顯，與AS組相比差異顯著(p＜0.01)。(4)qRT-PCR結(jié)果顯示，AS組小鼠主動(dòng)脈組織中KC、CXCR2、TNF-α、γ-IFN、mef2a、PCNA表達(dá)量增高，與control組比較差異顯著(p＜0.01)。應(yīng)用G31P處理組上述各指標(biāo)表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。(5)免疫組化結(jié)果顯示，AS小鼠

16、主動(dòng)脈組織中CXCR2、MMP-2、MMP-9、mef2a、PCNA的表達(dá)顯著增高，G31P可顯著抑制上述各因子在主動(dòng)脈血管組織中的表達(dá)，差異顯著(p＜0.01)。
　　3、第三部分實(shí)驗(yàn):(1)大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(A7r5)中存在IL-8/CXCL8受體CXCR2的表達(dá);(2)IL-8/CXCL8可刺激A7r5細(xì)胞增殖和遷移，且具劑量依賴(lài)性，并從20ng/ml濃度開(kāi)始增殖和遷移效應(yīng)顯著（與control相比，p＜0.01）;(

17、3)G31P可有效的抑制IL-8/CXCL8(20ng/ml)誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞的增殖和遷移(p＜0.01);(4)IL-8/CXCL8誘導(dǎo)A7r5細(xì)胞后，P-ERK表達(dá)量增加，且在IL-8/CXCL8作用后1小時(shí)達(dá)峰值，G31P可顯著抑制IL-8/CXCL8誘導(dǎo)的P-ERK的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1、G31P可通過(guò)降低血清中CHO、TG和LDL-C并升高HDL-C來(lái)改善高脂飲食引起的高脂血癥，并通過(guò)降低IL-8/CXCL

18、8、TNF-旺、γ-IFN等炎性細(xì)胞因子的表達(dá)抑制小鼠主動(dòng)脈血管組織的炎癥反應(yīng)。
　　2、G31P可在一定程度上延緩冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的形成。
　　3、G31P可抑制動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中CXCR2的表達(dá)以及MMP-2、MMP-9、mef2a、PCNA的表達(dá)，從而抑制血管平滑肌細(xì)胞細(xì)胞的增殖遷移。
　　4、G31P在體外可抑制由IL-8/CXCL8誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移。
　　5、IL-8/CXCL8誘導(dǎo)