降解絲素蛋白微生物的分離篩選及分類鑒定.pdf

1、隨著蠶絲綜合利用的進展，絲蛋白降解產(chǎn)物的用途日益廣泛。目前降解絲素生產(chǎn)絲肽主要采用鹽解法、酸解法、堿解法等化學(xué)方法，但鹽解法只能得到大分子的再生絲素粉，酸解法和堿解法則不可避免地會造成氨基酸的破壞，并且這些方法都需要脫鹽、脫酸等復(fù)雜的后處理。因此，采用酶解法生產(chǎn)絲肽是一種比較理想的方法，但絲素蛋白是一種典型的β-角蛋白，很難被普通的蛋白酶降解。雖然目前已從蠶蛾及微生物中分離到可以降解絲素的蛋白酶，但由于來源有限或穩(wěn)定性差等原因，無法在實

2、踐中應(yīng)用。有鑒于此，本文首次從土壤中分離到7株能以繭絲作為唯一碳源和氮源的微生物，探討了這些微生物對絲素、羽毛等角蛋白的分解能力，并對其中一株降解能力最強的微生物的生物學(xué)特性和分類學(xué)地位進行了研究，從而為進一步深入研究微生物源絲蛋白酶奠定了基礎(chǔ)。主要取得如下結(jié)果： 1.以泰山柞樹林和山東農(nóng)業(yè)大學(xué)草坪的表層土為材料，通過建立適合目的微生物生長的條件，進行富集增菌；采用涂布與劃線相結(jié)合的方法分離純化培養(yǎng)物。最終得到7株可以利用絲素蛋

3、白作為唯一碳源和氮源進行生長的培養(yǎng)物。 2.對分離得到的7株可以降解絲素蛋白的微生物，根據(jù)其在不同溫度、營養(yǎng)條件下對絲綢條的降解效果，以及對未經(jīng)高溫蒸煮的絲綢條的降解情況，進行了進一步的篩選。發(fā)現(xiàn)在這7株微生物中，編號為C3的放線菌降解絲素蛋白的活性最高。在缺乏碳源的情況下，可以在14d之內(nèi)使絲綢條完全降解斷裂，這與意大利學(xué)者分離得到的微生物相比，有更高的活性；C1、C2、C3等3個菌株對未經(jīng)高溫蒸煮的絲綢條也有較強的降解能力。

4、 3.各菌株對其他角蛋白的降解試驗表明，對羽毛角蛋白無論是否經(jīng)過高溫蒸煮，這7株微生物都有良好的降解效果，只是未經(jīng)高溫蒸煮的羽毛，降解速度有所降低。各菌株對以羊毛為代表的α-角蛋白也有一定的降解能力，但活性較低，但羊毛經(jīng)過高溫蒸煮之后，更易于被降解。 4.測定了C3菌株對絲素蛋白的降解活性以及溫度和營養(yǎng)條件對其降解活性的影響。在28～37℃之間C3菌株對絲綢條均保持較高的降解活性；在營養(yǎng)條件中，大量碳源的存在會明顯降低其

5、活性，但少量碳源的影響不明顯；氮源對其影響不大；在缺乏碳源的高氏一號合成培養(yǎng)基中，對絲素蛋白的降解效果最好。在1％絲素蛋白作為唯一碳源和氮源的色氨酸培養(yǎng)基中，28℃200rpm恒溫培養(yǎng)條件下，在接種后第6天至第12天，培養(yǎng)液中游離氨基酸和多肽的濃度增幅最大，即在此階段對絲素蛋白的降解活性最高。與已報道的Variovoraxparadoxus相比，達(dá)到峰值的時間明顯縮短。電鏡觀察表明，接種C3菌株第14d的絲綢條在一些部位出現(xiàn)明顯的降解凹

6、陷；接種21d時，絲纖維已不成形，表面覆蓋大量的粘液狀降解物。 5.對分離到的7株微生物的類型進行了鑒定，通過孟加拉紅、鏈霉素以及重鉻酸鉀的敏感性試驗證明，這7株菌均屬于放線菌。重點探討了降解絲素能力最強的C3菌株的生物學(xué)特點和分類地位，16SrDNA的序列同源性比較表明，C3菌株與一株擬無枝酸菌Amycolatopsisfastidiosa的同源性最高，在菌絲、孢子絲、孢子形態(tài)、生理生化特征、細(xì)胞化學(xué)特征等方面，C3菌株與《放