白藜蘆醇改善高脂喂養(yǎng)大鼠胰島素抵抗和肝臟脂毒性機制的研究.pdf

1、本研究分為四部分： 第一部分、大鼠正糖-高胰島素鉗夾術的改進 目的：在經(jīng)典正糖-高胰島素鉗夾術基礎上對插管技術進行改進，利用尾動靜脈插管技術實施清醒狀態(tài)下大鼠高胰島素-正糖鉗夾實驗并對該技術進行評價。 方法：正常喂養(yǎng)和高脂喂養(yǎng)Wistar大鼠各5只，喂養(yǎng)4周后，清醒狀態(tài)下鼠尾根局部麻醉，分別尾動靜脈插管，由尾靜脈輸入胰島素(速度O 25u/kg·h)和葡萄糖，尾動脈采血，進行高胰島素-正糖鉗夾實驗。 結果

2、：尾動靜脈插管術后大鼠血糖在正常范圍內(nèi)，術后血糖無明顯波動；高脂喂養(yǎng)組大鼠的葡萄糖輸注率顯著低于對照組(P<0.01)，表明高脂喂養(yǎng)的大鼠有胰島素抵抗。 結論：尾動靜脈插管技術基礎上的高胰島素-正糖鉗夾實驗是可行的，較傳統(tǒng)插管技術，具有簡便易行、縮短實驗周期、大鼠死亡率低的優(yōu)點。 第二部分、白藜蘆醇改善高脂喂養(yǎng)大鼠胰島素抵抗、脂肪肝及其機制的研究 目的：觀察白藜蘆醇是否能夠改善高脂喂養(yǎng)所導致大鼠的胰島素抵抗和非酒

3、精性脂肪肝(NAFLD)并探討其機制。 方法：急性實驗：10只Wistar大鼠分成兩組(每組5只)，對照組和白藜蘆醇處理組，處理組白藜蘆醇(100mg／kg.day)灌胃，對照組生理鹽水灌胃，4小時后均處死，檢測肝臟內(nèi)AMPK磷酸化水平。慢性實驗：30只Wistar大鼠平均分為3組(每組10只)：正常對照組(標準飼料喂養(yǎng))，高脂組(高脂飼料喂養(yǎng))，和白藜蘆醇組，其中白藜蘆醇組全程高脂飼料喂養(yǎng)，并從第7周開始用白藜蘆醇干預治療(1

4、00mg／kg.day)，各組均喂養(yǎng)16周。以正糖-高胰島素鉗夾技術評價大鼠IR,肝臟石蠟切片HE染色觀察病理學改變，肝臟冰凍切片油紅O染色觀察肝細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積狀況，WestemBlot免疫印跡檢測肝臟內(nèi)AMPK磷酸化水平，RT-PCR檢測肝臟固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白-1C(SREBP-1c)和脂肪酸合成酶(FAS)的mRNA基因表達。 結果：急性實驗結果：白藜蘆醇干預組肝臟組織內(nèi)AMPK磷酸化水平增高到對照組的164．2％；慢性實

5、驗結果：高脂喂養(yǎng)組大鼠與對照組相比，內(nèi)臟脂肪指數(shù)、肝指數(shù)增高(P<0．05)，空腹胰島素水平增高、葡萄糖輸注率下降(P<0.01)，光鏡下肝臟出現(xiàn)明顯脂肪變性，肝組織內(nèi)AMPK磷酸化水平降低到對照組的45．8％(P<0．01)，同時脂質(zhì)合成基因SREBP-1c和FAS的mRNA表達量顯著增多；白藜蘆醇治療后的大鼠，內(nèi)臟脂肪含量顯著下降(P<0．01)，空腹胰島素水平降低、葡萄糖輸注率明顯增加(P<0.01)，光鏡下的肝臟脂肪變性得到明顯

6、改善，肝組織內(nèi)的AMPK磷酸化水平提高到對照組的70．2％(P<0.05)，與此同時脂質(zhì)合成基因SREBP-1c和FAS的mRNA表達量降低。 結論：白藜蘆醇可以在體內(nèi)促進肝臟內(nèi)AMPK活性；白藜蘆醇治療可以改善高脂喂養(yǎng)大鼠的IR同時減少肝臟內(nèi)脂質(zhì)沉積從而改善脂肪肝，其機制是通過激活AMPK而抑制下游脂質(zhì)合成途徑。 第三部分、白藜芒醇可通過激活AMPK途徑減少肝細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積 目的：觀察白藜蘆醇是否能夠直接作用于

7、肝細胞而減少肝細胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積，并深入探討其機制。 方法：HepG2細胞種植于6空板內(nèi)，當細胞融合到80％單層貼壁細胞時血清饑餓過夜后，分別加入含0μM、10μM、25μM、50μM的白藜蘆醇的低糖DMEM培養(yǎng)基孵育6小時和24小時后提取細胞蛋白檢測細胞內(nèi)AMPK水平；將HepG2培養(yǎng)于含25mmol／L葡萄糖和10mm／L的胰島素培養(yǎng)基分別培養(yǎng)24小時誘導細胞脂肪變性模型，然后以50μM白藜蘆醇濃度干預脂肪變性模型細胞24小時

8、，提取蛋白后WesternBlot免疫印跡檢測細胞內(nèi)AMPK磷酸化水平；Trizol提取細胞內(nèi)mRNA檢測固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白-1c(SREBP-1c)和脂肪酸合成酶(FAs)的基因表達水平，同時油紅O染色檢測細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積和提取細胞內(nèi)脂質(zhì)檢測細胞內(nèi)TG含量。 結果：白藜蘆醇呈劑量、時司依賴性促進細胞內(nèi)AMPKα磷酸化。HepG2細胞脂肪變性模型組出現(xiàn)明顯的紅色脂滴聚集(油紅O染色顯示)，細胞內(nèi)TG含量顯著高于對照組(P<0.0

9、1)，AMPK磷酸化水平降低到對照組的33 5％，SREBP-1c、FAS基因表達量分別增高到對照組的182％和167％；白藜蘆醇處理組HepG2油紅O染色和細胞內(nèi)TG定量均顯示脂肪變性得到明顯改善，AMPK磷酸化水平恢復到對照組的72 6％，而SREBP-1c和FAs的基因表達量也顯著下降。 結論：白藜蘆醇可以在體外提高肝細胞內(nèi)AMPK活性；白藜蘆醇可以直接作用于肝細胞減少肝細胞內(nèi)TG沉積，其機制是激活AMPK后抑制下游的SR

10、EBP-1c、FAS的基因表達進而抑制脂質(zhì)合成。 第四部分、白藜芒醇改善高脂誘導胰島素抵抗大鼠氧化應激 目的：觀察白藜蘆醇是否能夠減輕高脂誘導IR模型大鼠體內(nèi)氧化應激，并探討氧化應激與IR關系。 方法：動物造模分組同本文第二部分，高胰島素-正糖鉗夾術檢測胰島素敏感性，試劑盒分別檢測血清標本羥自由基、MDA水平和SOD活性，ELISA法檢測血清TNF-α濃度。 結果：模型組大鼠血清羥自由基、MDA、TNF-