糖調控載脂蛋白A5基因的表達.pdf

1、第一章糖對肝癌原代細胞載脂蛋白A5表達的影響
　　目的：明確D-葡萄糖及其類似物是否影響載脂蛋白A5(apolipoprotein A5，apoA5)表達，并探討糖及其類似物影響apoA5表達的調控機制。
　　方法：
　　1.不同濃度的D-葡萄糖(5mM，10mM，15mM，20mM，25mM)干預人肝癌原代細胞48h，及25mM D-葡萄糖干預人肝癌原代細胞不同時間(6h，12h，24h，48h)后，采用實時熒光定量

2、PCR(real-time polymerase chain reaction，Real-time PCR)及蛋白免疫印跡法(western blotting，WB)測定apoA5表達。
　　2.不同濃度的D-果糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-甘露醇(5mM，25mM)干預人肝癌原代細胞48h，采用Real-time PCR及WB測定apoA5表達。
　　3.不同濃度的D-葡萄糖(5mM，25mM)干預小鼠肝癌原代細胞(24

3、h，48h)后，采用Real-time PCR及WB測定apoA5表達。
　　結果：
　　1.D-葡萄糖可呈濃度依賴性和時間依賴性增加入肝癌原代細胞apoA5 mRNA及蛋白表達(P<0.05)。
　　2.D-葡萄糖類似物增加入肝癌原代細胞apoA5 mRNA及蛋白表達(P<0.05)。
　　3.D-葡萄糖可呈濃度依賴性和時間依賴性增加小鼠肝癌原代細胞apoA5 mRNA及蛋白表達(P<0.05)。
　　結

4、論：
　　1.D-葡萄糖及其類似物與apoA5表達水平密切相關，隨D-葡萄糖及其類似物濃度增加，apoA5表達增加。
　　2.D-葡萄糖及其類似物介導apoA5表達上調，這種調控機制可能涉及糖酵解途徑。
　　第二章轉錄因子USF1/2對載脂蛋白A5基因表達調控的研究
　　目的：探討轉錄因子USF1和USF2對載脂蛋白A5基因表達的轉錄調控及其作用機制。
　　方法：
　　1.不同濃度的D-葡萄糖(5mM

5、，25mM)干預人肝癌原代細胞48h后，采用Real-timePCR及WB測定USF1和USF2表達。
　　2.不同濃度的D-葡萄糖(5mM，25mM)干預人肝癌原代細胞48h后，采用染色質免疫沉淀(chromatin immunoprecitation，ChIP)技術，確定USF1和USF2與apoA5啟動子的結合情況。
　　結果：
　　1.D-葡萄糖不改變USF1和USF2的mRNA與蛋白在人肝癌原代細胞中的表達水

6、平(P>0.05)。
　　2.染色體免疫沉淀實驗證實D-葡萄糖能增加轉錄因子USF1/USF2與人apoA5啟動子的結合(P<0.05)。
　　結論：
　　在人肝癌原代細胞中轉錄因子USF1/2可在轉錄水平調節(jié)apoA5表達，此調節(jié)作用是通過轉錄因子USF1/2與apoA5啟動子區(qū)域的E盒結合并激活其啟動子活性。
　　第三章 Real-time PCR檢測人載脂蛋白A5基因的方法學建立及初步應用
　　目的：

7、采用TaqMan-MGB探針技術建立一種檢測人載脂蛋白A5基因的實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)新方法。
　　方法：
　　1.以重組克隆質粒pPCR-Script-apoA5為模板，確定實時熒光定量PCR的最佳循環(huán)參數(反應條件)及反應體系，建立最優(yōu)化的實時熒光定量PCR方法，并對其進行方法學評價(包括重復性、特異性、線性范圍等)。
　　2.將建立的實時熒光定量PCR法用于2型糖尿病患者及健康體檢者全血標本的檢測，以

8、驗證該方法的臨床應用價值。
　　結果：
　　1.以重組克隆質粒為模板，確定實時熒光定量PCR的最佳反應條件(循環(huán)參數)為：95℃5min；95℃30sec，55℃30sec，72℃30sec(40cycles)。
　　2.20μl最適反應體系為：Mg2+濃度2.5mM、引物濃度1.0μM、探針濃度1.0μM、dNTP250μM、10×buffer3μl、Taq DNA聚合酶1.0U、DNA模板2.0μl。
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