海水魚致病性弧菌的分子生物學(xué)鑒定和OmpK共同抗原性研究.pdf

1、弧菌(Vibrios)是海水養(yǎng)殖動物的主要病原菌之一，可危害多種水生動物。常規(guī)全菌滅活疫苗在防治海水魚弧菌病方面發(fā)揮了積極作用，但弧菌種類多，血清型復(fù)雜，不同血清型疫苗間缺乏交叉免疫保護(hù)，限制了弧菌全菌疫苗的應(yīng)用。因此，有必要研制一種應(yīng)用范圍廣泛的新型弧菌疫苗來預(yù)防海水養(yǎng)殖魚類弧菌病。解決此問題的關(guān)鍵在于找出致病性弧菌的共同保護(hù)性抗原，制備對不同種、不同血清型菌株都有保護(hù)作用的疫苗。弧菌的外膜蛋白OmpK具有良好的免疫原性，是弧菌的保護(hù)

2、性抗原之一。本研究在采用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行魚類致病性弧菌的種屬鑒定的基礎(chǔ)上，對19株弧菌的OmpK基因進(jìn)行了克隆和序列測定，分析了外膜蛋白OmpK的免疫原性和共同抗原性，探討了重組OmpK疫苗的交叉免疫效果與OmpK氨基酸序列同源性之間的關(guān)系，為獲得具有交叉免疫效果的弧菌重組疫苗奠定基礎(chǔ)。 1.海水魚類致病性弧菌的種類鑒定為進(jìn)一步鑒定流行于我國南方沿海的弧菌種類，根據(jù)GenBank中登錄的弧菌HSP60基因保守序列設(shè)計(jì)一對引物，

3、分別從19株病原菌總DNA中擴(kuò)增得到約600bp的條帶，產(chǎn)物經(jīng)純化后進(jìn)行序列測定。所測基因序列與GenBank中已登錄的弧菌屬HSP60基因進(jìn)行匹配排列，確認(rèn)19株病原菌中11株為哈維氏弧菌、6株為溶藻弧菌、2株為副溶血弧菌。 2.19株弧菌外膜蛋白OmpK基因克隆及序列分析根據(jù)GenBank上登錄的弧菌OmpK基因的保守序列設(shè)計(jì)一對簡并引物，以弧菌總DNA為模板，分別對上述19株弧菌的OmpK基因進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后克

4、隆至pMD18-TVector，挑取陽性重組子進(jìn)行序列測定。測序結(jié)果表明，所克隆的19株弧菌外膜蛋白OmpK基因都含有一個完整的開放讀碼框(ORF)，以ATG為啟始密碼子，TAA為終止密碼子，讀碼框大小為786～849個堿基。各菌株OmpK基因序列相似性為72％～100％，平均值為85.4％，其推測氨基酸序列相似性為71％～100％，平均值為88.5％。根據(jù)OmpK氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹并比較其種內(nèi)和種間相似性，除哈維氏弧菌菌株BsG

5、R021101外，同種弧菌分別聚類。同種弧菌不同菌株OmpK氨基酸序列之間的平均相似性為：哈維氏弧菌95.8％，溶藻弧菌87.6％，副溶血弧菌100％。 3.外膜蛋白OmpK的共同抗原性分析弧菌外膜蛋白OmpK基因序列分析表明外膜蛋白OmpK基因普遍存在于海水魚致病性弧菌中。19株弧菌外膜蛋白OmpK基因之間的堿基序列、推導(dǎo)氨基酸序列的相似性較高，進(jìn)而從分子水平推測外膜蛋白OmpK是哈維氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌的共同抗原。為

6、驗(yàn)證此結(jié)論，以重組外膜蛋白OmpK和提取的18株異源弧菌的外膜蛋白OMP為抗原，兔抗重組OmpK血清為一抗進(jìn)行免疫印跡分析。Western-blotting結(jié)果顯示：18株弧菌的OMP均能與兔抗重組OmpK血清產(chǎn)生免疫印跡條帶，說明不同菌株的外膜蛋白OmpK具有相同免疫原性。OmpK是弧菌的共同抗原，是很好的亞單位疫苗候選成分，為弧菌亞單位疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。 4.重組OmpK疫苗的交叉免疫保護(hù)率與OmpK氨基酸序列同源性相關(guān)關(guān)

7、系用重組OmpK疫苗對鯽魚進(jìn)行免疫，28d后分別用6株弧菌攻毒，并測定重組OmpK疫苗的交叉免疫保護(hù)率。結(jié)果顯示重組OmpK疫苗對同源菌株的保護(hù)率可達(dá)100％，對異源菌株FJ8、EcGS020401、EcGY020401、EiGR021101和SpGY020601的保護(hù)率分別為33.3％、50％、58.3％、66.7％、83.3％，隨著氨基酸序列同源性升高重組OmpK疫苗對異源菌株的交叉免疫保護(hù)率具有上升趨勢。相關(guān)分析表明，OmpK疫苗

8、交叉免疫保護(hù)率與相應(yīng)菌株OmpK氨基酸同源性之間存在較好的線性關(guān)系(r1=0.9779)，且在0.01水平呈正相關(guān)關(guān)系。這就是說不同菌株OmpK氨基酸之間同源性越高，OmpK疫苗相對交叉免疫保護(hù)率就越高。初步闡明了重組OmpK疫苗交叉免疫保護(hù)的分子基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明不同佐劑對重組OmpK亞單位疫苗的免疫保護(hù)率的影響存在著差異，其中MontanideIMS1312組平均免疫效果最好，且能夠較好的顯現(xiàn)OmpK疫苗免疫效果與OmpK氨基酸序