Sonichedgehog改善1型糖尿病小鼠內(nèi)皮祖.pdf

1、【背景】
　　隨著經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展和生活方式的快速轉(zhuǎn)變，糖尿病在中國不僅發(fā)病率高，而且處于快速增長階段。最新調(diào)查表明目前中國糖尿病患者有9千多萬，準(zhǔn)糖尿病患者已達(dá)1億4千多萬。代謝紊亂導(dǎo)致的糖尿病血管并發(fā)癥，是糖尿病患者致死、致殘的主要原因。如何有效預(yù)防和治療糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展，成為亟待解決的問題。
　　內(nèi)皮的再生減弱和血管新生受損導(dǎo)致了糖尿病微血管和大血管的并發(fā)癥。內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙是糖尿病血管病變的關(guān)鍵和始動(dòng)因素。

2、自從1997年,Asahara等首次證明循環(huán)外周血中存在能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells,EPCs），越來越多的研究證明EPCs具有修復(fù)血管內(nèi)皮和維持血管完整性的作用，并且在血管新生中發(fā)揮重要作用。而大量研究發(fā)現(xiàn)糖尿病患者EPCs數(shù)量減少，增殖減弱、黏附和血管形成能力明顯下降。EPCs功能障礙在糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。然而有關(guān)糖尿病 EPCs數(shù)量減少和功能障礙的

3、機(jī)制尚不清楚。因此進(jìn)一步闡明糖尿病EPCs功能障礙的機(jī)制，找到改善EPCs功能的策略，有望成為預(yù)防和治療糖尿病血管并發(fā)癥的有效策略。
　　Hedgehog信號(hào)通路在胚胎發(fā)育期調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、組織的形成和器官的發(fā)生，在出生后及成年期可維護(hù)組織的穩(wěn)態(tài)及受損后的修復(fù)及再生。許多的研究表明Hedgehog信號(hào)通路可以促進(jìn)多種組織中血管的生長，缺血損傷時(shí)激活Hedgehog通路可促進(jìn)血管新生的生成過程。而且近年的一些研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病動(dòng)物模型

4、中，激活Hedgehog信號(hào)通路可改善多種糖尿病的并發(fā)癥。我們之前的研究也證實(shí)在糖尿病傷口表面給予Sonic hedgehog（Shh）蛋白治療后，可以促進(jìn)糖尿病皮膚傷口的愈合。并且在1型糖尿病小鼠心肌梗死模型中，給予Shh信號(hào)通路受體激動(dòng)劑，能顯著改善心肌梗死后的心臟功能。然而Shh信號(hào)通路改善糖尿病并發(fā)癥的機(jī)制不明，有待進(jìn)一步研究。
　　因此我們提出以下研究設(shè)想：Shh信號(hào)通路通過改善EPCs的功能障礙，促進(jìn)糖尿病血管新生，進(jìn)

5、而改善糖尿病并發(fā)癥。EPCs的功能障礙與Shh信號(hào)通路受損有關(guān)。
　　本課題以1型糖尿病小鼠和糖尿病小鼠下肢缺血為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，分離培養(yǎng)糖尿病EPCs，從體內(nèi)和體外探討了糖尿病EPCs的Shh通路受損，激活Shh通路通過改善糖尿病EPCs功能障礙，增加EPCs動(dòng)員，促進(jìn)糖尿病的血管新生，進(jìn)而改善糖尿病并發(fā)癥，并初步探討了糖尿病EPCs的Shh通路受損的機(jī)制。為糖尿病血管病變的治療提供新的理論依據(jù)和治療策略。
　　第一部分Soni

6、c hedgehog促進(jìn)1型糖尿病小鼠血管新生的研究
　　目的
　　探討Shh對(duì)1型糖尿病小鼠血管新生的作用。探討Shh對(duì)1型糖尿病小鼠EPCs動(dòng)員和功能的作用。
　　方法
　　建立1型糖尿病小鼠模型，用血糖和體重指標(biāo)觀察糖尿病小鼠成模情況。在糖尿病7周制作小鼠下肢缺血模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在小鼠下肢缺血手術(shù)后立即藥物干預(yù)，分別給予 Shh信號(hào)通路受體激動(dòng)劑 SAG（5mg/kg/d）和拮抗劑 SANT（3.3mg/kg

7、/d），每天一次，并持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。在下肢缺血手術(shù)后第1天、7天和14天用激光多普勒血流儀檢測各組小鼠下肢的血流灌注情況；應(yīng)用免疫熒光方法檢測毛細(xì)血管密度；流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠外周血EPCs數(shù)量；并采用密度梯度法分離培養(yǎng)各組小鼠的內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用免疫熒光鑒定EPCs；Transwell法檢測EPCs的遷移能力；Matrigel法檢測EPCs的小管形成能力；Western-blot方法檢測Shh信號(hào)通路中Shh，Ptc1和Gli1的蛋

8、白表達(dá)水平。
　　結(jié)果
　　1.成功建立1型糖尿病小鼠模型，從第1周開始1型糖尿病小鼠血糖顯著升高，體重降低，一直持續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)束。
　　2.在糖尿病7周制作下肢缺血模型，1型糖尿病小鼠下肢的血流灌注恢復(fù)比正常對(duì)照小鼠顯著延遲，Shh通路受體激動(dòng)劑SAG治療可明顯改善糖尿病小鼠后肢的血流灌注。拮抗劑SANT-1則進(jìn)一步減少血流灌注。
　　3.糖尿病小鼠下肢缺血處的新生血管密度比正常對(duì)照組明顯減少。而SAG治療組小鼠血

9、管密度比糖尿病小鼠增多。
　　4.糖尿病小鼠外周血EPCs動(dòng)員數(shù)量明顯少于正常對(duì)照小鼠。激動(dòng)劑SAG增加糖尿病小鼠外周血EPCs動(dòng)員，給予拮抗劑SANT-1的糖尿病小鼠外周血EPCs動(dòng)員數(shù)量比糖尿病小鼠更少。
　　5.1型糖尿病小鼠體內(nèi)給予激動(dòng)劑SAG后，受損的內(nèi)皮祖細(xì)胞的遷移和小管形成能力得到改善。
　　6.糖尿病小鼠EPCs的Shh通路受損，給予激動(dòng)劑SAG可部分上調(diào)受損的通路。
　　小結(jié)
　　1.1型

10、糖尿病小鼠的血管新生受損，Shh通路激活劑 SAG可以促進(jìn)糖尿病小鼠的血管新生，部分恢復(fù)糖尿病小鼠的血流灌注。
　　2.體內(nèi)給予Shh通路激動(dòng)劑SAG可增加1型糖尿病小鼠EPCs動(dòng)員，改善糖尿病小鼠EPCs功能障礙。
　　3.糖尿病小鼠EPCs的Shh信號(hào)通路下調(diào)，體內(nèi)給予激動(dòng)劑SAG可上調(diào)受損的通路。
　　第二部分Sonic hedgehog改善1型糖尿病小鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的研究
　　目的
　　觀察1型糖

11、尿病小鼠EPCs的功能改變，和激活Shh通路對(duì)糖尿病EPCs功能的改善作用。并探討糖尿病小鼠EPCs的 Shh通路下調(diào)的機(jī)制。
　　方法
　　1.建立1型糖尿病小鼠模型。在糖尿病第7周采用密度梯度法分離并培養(yǎng)糖尿病小鼠和正常對(duì)照小鼠的內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。給予 Shh通路配體蛋白Shh和受體激動(dòng)劑SAG，用MTT法檢測EPCs的增殖能力；Transwell法檢測EPCs的遷移能力；Matrigel法檢測EPCs的小管形成能力；

12、β-半乳糖苷酶染色檢測EPCs的衰老。
　　2.分離培養(yǎng)小鼠的內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。給予糖基化終末產(chǎn)物AGEs；給予Shh通路受體激動(dòng)劑 SAG，AKT抑制劑 LY294002，蛋白酶體抑制劑 MG132和GSK-3β抑制劑LiCl，Western-blot方法檢測Shh信號(hào)通路中Gli1和Gli2的蛋白表達(dá)水平和AKT/GSK3β信號(hào)通路中AKT和GSK3β的活性。
　　結(jié)果
　　1.1型糖尿病小鼠與正常對(duì)照組相比，E

13、PCs功能下降，體外給予Shh信號(hào)通路蛋白 Shh和受體激動(dòng)劑SAG，可增加糖尿病 EPCs增殖，改善遷移和小管形成能力，減少衰老。
　　2.晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）可使EPCs的Shh信號(hào)通路蛋白Shh、Ptc1蛋白表達(dá)下降。
　　3.1型糖尿病小鼠EPCs中的AKT活性下降，GSK-3β活性升高。
　　4.給予AKT抑制劑LY294002，使SAG激活的EPCs的Shh通路蛋白Gli1,特別是Gli2表達(dá)明顯下

14、降。而再同時(shí)給予蛋白酶體抑制劑MG132，Shh通路蛋白Gli1，Gli2表達(dá)回升。體外給予GSK-3β抑制劑LiCl，EPCs的Shh通路蛋白表達(dá)增加。
　　5.體外給予Shh信號(hào)通路激動(dòng)劑SAG，EPCs中的AKT活性增強(qiáng)。
　　6.給予AKT抑制劑LY294002，使SAG誘導(dǎo)的EPCs小管形成和遷移減弱。
　　小結(jié)
　　1.1型糖尿病小鼠EPCs功能受損，激活Shh通路，可改善糖尿病小鼠EPCs功能：EP

15、Cs增殖增加，小管形成能力和遷移能力增強(qiáng)，且衰老減少。
　　2.糖尿病EPCs的AKT活性下降導(dǎo)致其下游GSK3β活性增高，進(jìn)而使Shh信號(hào)通路受損。AKT活性下降抑制Shh通路激動(dòng)劑SAG誘導(dǎo)的EPCs的小管形成和遷移。
　　1.糖尿病小鼠的EPCs功能障礙，Shh信號(hào)通路下調(diào)，激活Shh通路可改善糖尿病EPCs的功能。
　　2. Shh通路激動(dòng)劑SAG通過改善EPCs的功能和增加EPCs動(dòng)員，促進(jìn)糖尿病小鼠血管新生