人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的純化方案及其生物學(xué)特性研究.pdf

1、第一章人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分離與純化方案的建立
　　 目的:一次性消化較大量胎盤組織,建立從胎盤組織中大量、高效的分離純化出人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞(human placental mesenchymal stem cell,hpMSC)的操作方案。
　　 方法:胎盤組織洗凈剪碎,用胰蛋白酶和 DNAseⅠ共同消化；分三個(gè)階段消化,每次37℃消化20 min。重懸消化產(chǎn)物用200目篩網(wǎng)過(guò)濾后用 Percoll不連續(xù)梯度密度分離液

2、分離,收集 hpMSC所在層。用 PBS洗兩遍后,直接接種于75 mm培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)、傳代。傳至第三代后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)表面標(biāo)志物,并做成脂、成骨誘導(dǎo)以鑒定。
　　 結(jié)果:經(jīng)胰蛋白酶和 DNAseⅠ共同消化后,胎盤組織僅剩少許殘?jiān)?。hpMSC接種19-21 d后細(xì)胞生長(zhǎng)至90％融合,細(xì)胞數(shù)目為:1.96±0.24×106個(gè)；傳代細(xì)胞培養(yǎng)4-5 d即可再次傳代。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:hpMSC強(qiáng)表達(dá) CD29、CD44、CD73、

3、CD90、CD105和 HLAⅠ類分子,不表達(dá) CD34、CD45、CD14和 HLA-Ⅱ類分子,經(jīng)誘導(dǎo)后向成骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞方向分化,可被茜素紅染和油紅 O染色。
　　 結(jié)論:采用胰蛋白酶和DNAseⅠ共同消化胎盤組織,結(jié)合Percoll不連續(xù)密度梯度分離液分離細(xì)胞,可一次性獲得較多的hpMSC。此方法成本適中,對(duì)細(xì)胞損傷小,所獲得細(xì)胞純度和活力都令人滿意,可以應(yīng)用于hpMSC的大規(guī)模培養(yǎng),滿足臨床和科研應(yīng)用的需求,也適用于建

4、立間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)。
　　 第二章 hpMSC的超微結(jié)構(gòu)觀察和吞噬功能研究
　　 目的:本研究旨在了解 hpMSC的超微結(jié)構(gòu)和理解細(xì)胞的特性和生理功能。
　　 方法:選取5例正常娩出胎盤來(lái)源的 hpMSC,經(jīng)體外培養(yǎng)后進(jìn)行固定、包埋、切片、染色,在透射電子顯微鏡下觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu):在培養(yǎng)上清中添加熒光微球,孵育3 h后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的吞噬能力。
　　 結(jié)果:hpMSC在透射電鏡下表現(xiàn)為細(xì)胞核比較大,

5、核仁明顯；核膜折疊、內(nèi)陷顯著,常染色質(zhì)多,核漿比例正常。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)系統(tǒng)發(fā)達(dá),可見大量狹小或擴(kuò)張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。胞漿內(nèi)高爾基器、溶酶體或脂褐素常見；細(xì)胞表面微絨毛發(fā)達(dá),偶可見細(xì)胞間連接。5個(gè)標(biāo)本的hpMSC均有部分細(xì)胞能吞噬熒光微球,但也有部分細(xì)胞沒(méi)有吞噬；最多有49.62％,最少18.4％的細(xì)胞吞噬了熒光微球。
　　 結(jié)論:hpMSC的超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)提示細(xì)胞功能活躍,可合成和分泌大量蛋白質(zhì),并可具有吞噬功能；而吞噬實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證 hpM

6、SC吞噬異物的能力。提示hpMSC在胎盤中可能起著維持微環(huán)境穩(wěn)態(tài)、清除異物的功能。
　　 第三章 hpMSC雌、孕激素受體表達(dá)及雌、孕激素對(duì)其分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和吞噬功能的影響
　　 目的:觀察hpMSC的雌、孕激素受體(estrogen/progestagen receptors,ER/PR)的表達(dá)情況,并分析雌二醇(estradiol,E2)和黃體酮(progesterone,P)對(duì) hpMSC分泌(vascula

7、r epithielial growth factor,VEGF)的影響以及對(duì)吞噬功能的影響。
　　 方法:取5個(gè)正常足月胎盤來(lái)源的hpMSC標(biāo)本,采用反轉(zhuǎn)錄熒光定量 PCR方法(fluorescent quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR)和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè) hpMSC的 ER、PR的表達(dá)情況。用 qRT-PCR方法和 ELISA方法檢測(cè) hpMSC表達(dá)和分泌 VEG

8、F的水平。將hpMSC用妊娠晚期水平的E2和 P孵育48 h,用 ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)上清中 VEGF水平,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)hpMSC吞噬熒光微球的能力。
　　 結(jié)果:5個(gè)標(biāo)本中每個(gè)標(biāo)本都有部分細(xì)胞 PR抗體染色陽(yáng)性,陽(yáng)性率為18.81±0.09％,但ER抗體染色均為陰性。5個(gè)標(biāo)本的hpMSC培養(yǎng)上清中均檢測(cè)到 VEGF(244.92±84.02 pg/ml)。與未處理的 hpMSC相比,用E2或P孵育的hpMSC的 VEGF

9、分泌水平提高(728.94±333.65 pg/ml,540.87±154.09 pg/ml)。用E2和P同時(shí)處理的hpMSC的VEGF分泌水平則顯著上升(1561.21±415.33pg/ml)。E2、P以及E2和P孵育后的hpMSC吞噬熒光微球能力與未處理的細(xì)胞相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 結(jié)論:hpMSC主要表達(dá)PR,而基本不表達(dá) ER;妊娠水平的E2和P都能夠上調(diào) hpMSC分泌 VEGF的水平；E2和P對(duì)

10、hpMSC吞噬功能沒(méi)有明顯的調(diào)控作用。
　　 第四章 hpMSC表達(dá)吲哚胺雙加氧酶,分泌可溶性免疫抑制分子與子癇前期的關(guān)系
　　 目的:從兩個(gè)角度對(duì)照正常妊娠 hpMSC和子癇前期(pre-eclampsia,PE)hpMSC之間的差異:①hpMSC分泌可溶性因子對(duì)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mixedlymphocyte reactions,MLR)的抑制作用:②hpMSC的吲哚胺雙加氧酶(Indoleamine2,3-Diox

11、ygenase,IDO)表達(dá)水平；即從hpMSC的角度探討 PE形成的可能機(jī)制。
　　 方法:應(yīng)用 Transwell做 MLR,將hpMSC接種于 Transwell上層,混合淋巴細(xì)胞接種于下層:共孵育96小時(shí)后吸出淋巴細(xì)胞,用 Cell Counting Kit-8(CCK-8)檢測(cè)細(xì)胞數(shù),計(jì)算淋巴細(xì)胞增殖抑制率。用含干擾素γ(Interfereron-γ,IFN-γ)的培養(yǎng)基孵育細(xì)胞48 h后,用qRT-PCR法和ELIS

12、A方法分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)hpMSC的IDO表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:hpMSC釋放的可溶性分子具有抑制淋巴細(xì)胞增殖的作用；hpMSC表達(dá)低水平的 IDO,但當(dāng)受到 IFN-γ刺激后,表達(dá)水平顯著提高(P<0.05)。對(duì)照正常組和子癇前期組 hpMSC對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的抑制率和表達(dá)IDO(包括受 IFN-γ刺激后)水平,差異均不具有顯著性(P>0.05)。
　　 結(jié)論:hpMSC所表達(dá)的IDO和釋放的可溶性分子