前列腺癌外周血微轉(zhuǎn)移的免疫磁珠分選和分子生物學(xué)檢測(cè).pdf

1、目的： 1、探討建立一種特異性和敏感性較高的免疫磁珠分選檢測(cè)前列腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的方法，以利于發(fā)現(xiàn)早期前列腺癌隱匿性微轉(zhuǎn)移，評(píng)估前列腺癌的預(yù)后，監(jiān)測(cè)術(shù)后前列腺癌復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移。 2、聯(lián)用免疫磁珠和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)前列腺癌患者外周血微轉(zhuǎn)移，評(píng)價(jià)其在判斷前列腺癌外周血微轉(zhuǎn)移發(fā)生中的臨床應(yīng)用價(jià)值。 方法： 1、體外培養(yǎng)前列腺癌LNCaP細(xì)胞，將其制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液和事先已與單克隆抗體(鼠抗人PSMA

2、單抗)預(yù)孵育的包被人抗鼠IgG抗體的磁珠作用，顯微鏡觀察其與免疫磁珠結(jié)合的情況，計(jì)算玫瑰花環(huán)形成率，并觀察其與不同濃度的單抗作用時(shí)的玫瑰花環(huán)形成率，摸索最佳反應(yīng)條件。臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)分選前后癌細(xì)胞存活率。將LNCaP細(xì)胞分別與外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)及全血細(xì)胞混合，與預(yù)孵育的免疫磁珠作用，磁架分離，顯微鏡觀察，進(jìn)行靈敏度的檢測(cè)。 2、本研究的臨床病例包括前列腺癌(PCa)組53例，年齡57～85歲，平均73歲，經(jīng)Jewett臨

3、床分期：B期7例，C期19例，D期27例：經(jīng)Gleason病理分級(jí)：高分化癌12例，中分化癌18例，低分化癌23例；良性前列腺增生(BPH)組30例，年齡35～88歲，平均68歲；正常對(duì)照組5例。 3、采集前列腺癌和BPH患者及正常對(duì)照組外周血5ml于EDTA-K2抗凝的真空管中，分離單個(gè)核細(xì)胞，應(yīng)用已經(jīng)建立的免疫磁珠檢測(cè)外周血微轉(zhuǎn)移前列腺癌細(xì)胞的方法學(xué)進(jìn)行分選，分選后的細(xì)胞提取RNA，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)PSA

4、mRNA來鑒定分選結(jié)果，從而判斷患者外周血微轉(zhuǎn)移的存在與否。PSAmRNA的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法是本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立的。本研究對(duì)聯(lián)用免疫磁珠和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR判斷前列腺癌外周血微轉(zhuǎn)移發(fā)生的臨床應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行了分析評(píng)價(jià)。 結(jié)果： 1、成功建立免疫磁珠法檢測(cè)外周血微轉(zhuǎn)移前列腺癌細(xì)胞的方法學(xué)。隨著PSMA單克隆抗體濃度的增高，LNCaP細(xì)胞與免疫磁珠的結(jié)合率也增高。當(dāng)單抗?jié)舛葹?μg/ml時(shí)，結(jié)合率最高，玫瑰花

5、環(huán)形成率可達(dá)到90％，單抗?jié)舛壤^續(xù)增加，二者結(jié)合率不再升高并略有下降。且分選后癌細(xì)胞存活率較之分選前未明顯改變。該方法敏感性高，當(dāng)PBMC與LNCaP細(xì)胞比例為106:1時(shí)可以檢測(cè)到癌細(xì)胞，檢測(cè)靈敏度可達(dá)20個(gè)腫瘤細(xì)胞/ml外周血。 2、臨床病例檢測(cè)結(jié)果：5例正常對(duì)照者中未檢測(cè)到陽性結(jié)果；30例BPH患者中檢測(cè)到1例陽性；53例前列腺癌患者中有23例陽性，陽性率43.4％，其中ECT證實(shí)的27例骨轉(zhuǎn)移癌患者中，有17例陽性，陽性