磁性附著體模擬靜磁場對成骨細胞生物學效應的基礎研究.pdf

1、脈沖電磁場(pulsed electromagnetic fields,PEMF)作為促進骨修復的一種方法已廣泛應用于臨床達20多年，其促進骨折愈合的療效已得到國內(nèi)外的證實。然而其作用機制是磁場效應占主導還是電場效應為主，直至目前尚未闡明。靜磁場(static magnetic fields,SMF)做為一種良好的力源為修復體提供輔助固位和作為正畸矯治力矯治錯合畸形，且體積小，無外設電源，便于長期局部應用，因而正被廣泛應用于口腔修復和正

2、畸領域。最近的研究表明靜磁場能促進新骨形成、預防種植體植入導致的骨密度降低以及促進牙槽骨改建。然而有關靜磁場對骨組織的生物學效應尚未取得一致結(jié)論，靜磁場對成骨細胞(osteoblasts)增殖、分化以及代謝的影響和作用機制，尚鮮見研究報道。因此，有必要對磁性附著體靜磁場對骨組織的影響作深入研究。 一．研究目的 本課題旨在通過模擬Magnetic 800磁性附著體靜磁場，對體外培養(yǎng)的SD大鼠成骨細胞進行三種強度(12.5

3、mT、125mT和250mT)、持續(xù)不同時間的靜磁場加載，通過對細胞形態(tài)和表面超微結(jié)構(gòu)觀察、增殖活力和細胞周期分布及凋亡分析、ALP和OCN活性測定、TGF-β<,1>mRNA的合成以及原癌基因c-jun表達的測定，從細胞、亞細胞、分子及基因水平上研究磁性附著體靜磁場對成骨細胞形態(tài)、增殖、分化和代謝的影響，探討靜磁場對骨組織的影響，從而為磁性附著體的臨床應用提供可靠的實驗依據(jù)。 二．研究方法 1．對成骨細胞進行靜磁場加載

4、，通過倒置相差顯微鏡觀察活細胞形態(tài)，HE染色光鏡觀察以及掃描電子顯微鏡觀察細胞表面超微結(jié)構(gòu)，研究靜磁場對成骨細胞形態(tài)的影響，并探討其影響機理。 2．對成骨細胞進行靜磁場加載，通過MTT比色法檢測細胞增殖活力，流式細胞術分析細胞周期分布，細胞凋亡分析。研究靜磁場對成骨細胞增殖特性的影響。 3．對成骨細胞進行靜磁場加載，通過酶聯(lián)免疫技術測定堿性磷酸酶活性，放射免疫技術檢測骨鈣素的合成，探討靜磁場對成骨細胞合成礦化蛋白的影響。

5、 4．靜磁場加載成骨細胞，采用熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈技術檢測TGF-β<,1>mRNA的表達水平，從基因水平研究靜磁場對成骨細胞合成細胞因子的影響。 5．靜磁場加載成骨細胞，利用熒光定量PCR技術結(jié)合免疫組化技術，檢測立即早期基因c-jun mRNA以及表達產(chǎn)物的變化，從蛋白水平和基因水平，探討靜磁場影響成骨細胞的作用機制。 三．結(jié)果 1．三種不同靜磁場強度持續(xù)加載成骨細胞1到7天，細胞生長狀態(tài)良好，均未

6、觀察到靜磁場對細胞形態(tài)、排列及分布的影響。125mT和250mT靜磁場加載3天，兩磁場處理組細胞表面微絨毛增多，并且融合形成微囊泡，加載5和7天后，細胞表面微囊泡數(shù)目增多，．形成較大微囊泡，還可見囊泡的破裂。12.5moT靜磁場持續(xù)加載5天和7天后，細胞表面出現(xiàn)較多的微囊泡。 2．三種不同靜磁場強度持續(xù)加載成骨細胞1到7天，對細胞增殖無明顯促進作用，各組細胞生長趨勢基本一致，無明顯的劑量一效應、時間一效應關系。各磁場組對細胞的各

7、周期分布、增殖指數(shù)及細胞凋亡率無明顯影響。 3．靜磁場加載1天，各磁場組對堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性無明顯。靜磁場加載3天，125mT和25mT磁場組ALP活性增強；靜磁場加載5天和7天，12.5mT、125mT和250mT各磁場強度組ALP活性明顯升高；而且125mT和250mT磁場組ALP活性明顯高于12.5mT；磁場組。持續(xù)靜磁場作用會增加ALP活性，存在時間一效應關系。靜磁場加載1

8、天和3天，對成骨細胞分泌骨鈣素(Osteocalcin,OCN)無明顯影響；靜磁場持續(xù)作用5天和7天，各磁場強度組骨鈣素分泌明顯增強，不同磁場強度之間骨鈣素分泌無明顯差別，無明顯劑量一效應關系。 4．在整個觀察期內(nèi)，靜磁場抑制TGF-β<,1>mRNA表達水平的下降。125mtT和250mT磁場加載組細胞的FGF-β<,1>tmRNA的表達水平，在各時段都明顯高于對照組和12.5mT磁場加載組相應時間段；12,5mT磁場加載組在

9、加載12小時、1天和3天，細胞的TGF-β<,1>mRNA的表達增強。 5．在整個觀察期內(nèi)，各磁場加載組細胞內(nèi)c-jun mRNA和蛋白產(chǎn)物的表達呈二過性升高：12.5mT磁場加載組加載6和12小時，c-jUnmRNA和蛋白產(chǎn)物的表達明顯升高，以后逐漸下降；125mT和250mT磁場加載組從加載2小時開始c-jun mRNA和蛋白產(chǎn)物的表達立即顯著升高，且分別持續(xù)到6小時和12小時，明顯高于對照組和12.5mT組。呈現(xiàn)一定的劑量

10、一效應關系。 四．結(jié)論 磁性附著體模擬靜磁場對體外培養(yǎng)SD大鼠乳鼠成骨細胞的形態(tài)、排列、增殖活性，細胞周期分布及細胞凋亡率無明顯影響，而靜磁場能使細胞合成c-jun、TGF-β<,1>、ALP和OCN的功能發(fā)生改變。推測靜磁場可能通過影響成骨細胞對c-jun的表達而影響啟動序列中含有AP-1結(jié)合位點的基因如TGF-β<,1>、ALP和OCN等的表達，刺激其表達升高，進而影響成骨細胞的分化，代謝和成熟。然而靜磁場對成骨細胞