腸出血性大腸桿菌O157：H7（EHEC O157：H7）基因工程多亞單位融合蛋白疫苗的實驗研究.pdf

1、腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC)O157:H7(本文簡稱O157)是一種重要的人畜共患傳染病病原菌。自1982年被確認(rèn)為致病菌以來的20多年中，世界各地包括中國都有不同規(guī)模的暴發(fā)流行。EHEC O157:H7感染可使人患腹瀉、出血性結(jié)腸炎(hemorrhagic colitis，HC)，還可在5～10％的病例中引發(fā)溶血性尿毒綜合征(hemolytic uremic syn

2、drome，HUS)及血栓性血小板減少紫癜(thromboticthrombocytopenic purpura，TTP)等嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。 O157的感染因具有暴發(fā)流行趨勢、強烈的致病性與致死性和抗生素治療可加劇病情的危險性等特點，已經(jīng)成為全球性的公共衛(wèi)生問題。然而目前對其感染仍缺乏有效的防治方法，研究證明：抗生素可促使O157菌釋放致死性志賀毒素(Stx)，從而使患者并發(fā)HUS的危險性增加。由于O157的暴發(fā)流行和治療

3、上的困難，疫苗成為預(yù)防和控制O157感染最簡單、經(jīng)濟(jì)、快捷的手段，發(fā)展有效的O157疫苗就顯得亟為緊迫。 由于O157菌體抗原成份復(fù)雜，含有多種致病因子，且與普通大腸桿菌有大量的共同抗原，易引發(fā)不良反應(yīng)，使O157全菌疫苗研究和應(yīng)用受到限制。隨著基因工程技術(shù)的成熟，亞單位基因工程疫苗將成為O157疫苗研究的主攻方向。 Ⅲ型分泌蛋白A(E.coli secreted protein A，EspA)、緊密粘附素(Intimi

4、n)及志賀毒素ⅡB亞單位(Shiga like toxin ⅡB subunit，Stx2B)為O157的重要保護(hù)性候選抗原，本課題在本實驗室前期對它們研究的基礎(chǔ)上，構(gòu)建EspA、IntiminC端免疫保護(hù)性片段及Stx2B的融合基因；并通過原核表達(dá)系統(tǒng)制備多亞單位融合蛋白；純化目的蛋白后對Balb/c小鼠進(jìn)行免疫后攻毒保護(hù)實驗，評價該疫苗的免疫保護(hù)率，為多亞單位O157疫苗的研制提供實驗依據(jù)。 本實驗完成了以下幾個方面的工作：

5、 1．espA-eaeC300(EI)融合基因的構(gòu)建、表達(dá)、純化及部分生物學(xué)性質(zhì)研究。 1.1采用PCR法自O(shè)157菌基因組擴增EspA的編碼基因espA和IntiminC300的編碼基因eaeC300。通過基因重組技術(shù)構(gòu)建融合基因espA-eaeC300，酶切、測序證實與預(yù)期序列完全一致。陽性重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，目的蛋白表達(dá)率約40％，SDS-PAGE分析目的蛋白的分子量約54KD

6、，超聲破菌后電泳證實目的蛋白以包涵體形式表達(dá)。Western blotting顯示融合蛋白EI具有與EspA和IntiminC300兔多抗血清的免疫反應(yīng)性。目的蛋白經(jīng)包涵體洗滌和親和層析純化后純度為90％，免疫家兔獲得了雙擴效價為1:32的多抗血清。 1.2重組融合蛋白EI生物學(xué)作用研究： 1.2.1 EHEC O157體外粘附細(xì)胞模型建立。選用培養(yǎng)簡單、生長周期較短、貼壁生長的HeLa細(xì)胞，將O157接種于HEPES-

7、DMEM液體培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)至對數(shù)生長期(OD<,600nm>≈0.6)，然后將貼壁生長在蓋玻片上的HeLa細(xì)胞與細(xì)菌于37℃、5％CO<,2>共同孵育4h，姬姆薩染色及電鏡觀察。結(jié)果顯示O157菌與HeLa細(xì)胞呈聚集性粘附。 1.2.2 采用EI兔抗血清與細(xì)菌預(yù)中和及細(xì)菌與抗體同時加入方法，與HeLa細(xì)胞粘附，用PBS洗去未粘附細(xì)菌，胰酶消化細(xì)胞，倍比稀釋后接種LB平板，計數(shù)單菌落，統(tǒng)計學(xué)分析EI兔抗血清阻斷粘附的效果。結(jié)果顯示

8、：抗體預(yù)先中和的O157菌與抗體同時加入的O157菌沒有顯著性差異(P>0.05)，表明EI多抗血清不能阻斷細(xì)菌與細(xì)胞的粘附。 1.2.3 用EI兔抗血清作為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗兔IgG作為二抗，檢測O157菌與HeLa細(xì)胞的粘附。結(jié)果顯示：EI兔抗血清可以與天然O157菌發(fā)生抗原抗體反應(yīng)。 1.2.4 FAS(Fluorescent actin staining)試驗檢測EI兔抗血清阻止O157菌與HeLa細(xì)胞間粘

9、附和擦拭性(attaching and effacing，A/E)損傷的效果。結(jié)果顯示：EI兔抗血清可以影響O157菌對HeLa細(xì)胞造成的A/E損傷。 2．espA-eaeC300-stx2b(EIS)融合基因的構(gòu)建、表達(dá)與純化 采用重疊延伸PCR的方法，EI為融合基因的前端，通過linker GSGGSG與stx2b相連接，從而獲得融合基因EIS；將融合基因構(gòu)建在原核表達(dá)載體pET-28a(+)中，通過酶切、測序證實與

10、理論預(yù)測值一致性為99.8％(1781/1784)。陽性重組子轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)后，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，目的蛋白表達(dá)率約30％，SDS-PAGE分析目的蛋白的分子量約64KD，超聲破菌后電泳證實目的蛋白以包涵體形式表達(dá)。目的蛋白經(jīng)包涵體洗滌和親和層析純化后純度為90％。Western blotting顯示融合蛋白EIS具有與EspA、IntiminC300兔多抗血清及兔抗O157:H7超聲上清血清的免疫反應(yīng)性，且表現(xiàn)出與Gb<

11、,3>的結(jié)合活性。 3．融合蛋白的動物免疫及攻毒保護(hù)試驗。 用純化后的EI和EIS重組蛋白免疫Balb/c小鼠，ELISA結(jié)果顯示血清特異性抗體的效價顯著增高，表明重組蛋白具有很強的免疫原性。以野生型O157活菌攻毒免疫保護(hù)實驗證明兩組融合蛋白均能有效保護(hù)活菌攻毒引起的Balb/c小鼠死亡，其中融合蛋白EIS對O157的感染保護(hù)率為92％，是各免疫組中最高的。O157超聲上清致死保護(hù)實驗結(jié)果顯示，融合蛋白EIS具有抗毒素

12、致死的保護(hù)作用，致死保護(hù)率為67％，表明融合蛋白中Stx2B亞單位抗原刺激機體產(chǎn)生能夠中和Stx毒素的抗體。 綜上所述，本研究成功表達(dá)了EI和EIS融合蛋白，建立了O157體外粘附細(xì)胞模型；通過對融合蛋白部分生物學(xué)功能研究顯示：EI和EIS均具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性；融合蛋白EI刺激機體產(chǎn)生的抗體具有一定的保護(hù)作用，其對于HeLa細(xì)胞的保護(hù)不是通過減少O157對細(xì)胞的粘附，而是通過阻斷A/E損傷的形成來發(fā)揮作用；融合蛋白E