小鼠β防御素-6的克隆和鑒定、小鼠β防御素-4、6以及人β防御素-3在肺組織中的表達研究.pdf

1、目的:(1)從小鼠肺組織里克隆mBD-6的cDNA。(2)觀察肺組織中小鼠β-防御素-4、6的基因表達水平，探討mBD-4、6在急性肺損傷發(fā)生發(fā)展中的作用。(3)研究小鼠β-防御素4、6在乳鼠和成年鼠肺部的表達和調(diào)控情況。(4)建立檢測hBD-3mRNA表達水平的實時熒光定量PCR方法，對肺癌患者的癌組織、正常肺組織進行檢測，從mRNA轉(zhuǎn)錄水平分析hBD-3基因在肺癌的表達，以便用于進行其與肺癌的關(guān)聯(lián)性的探討。 方法:(1)提取

2、大腸桿菌內(nèi)毒素腹腔注射后小鼠肺組織的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板，采用PCR的方法克隆小鼠β防御素-6基因。PCR產(chǎn)物連接入pGEM-EAST載體，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞，藍白篩選，對PCR鑒定含有目的片段的克隆進行測序。(2)將成年小鼠隨機分為兩組，一組為急性肺損傷組，一組為對照組。用大腸桿菌內(nèi)毒素腹腔注射復(fù)制急性肺損傷模型，于不同時間點處死小鼠，采用Trizol法提取肺組織總RNA，實時熒光定量RCR檢測肺組織beta-防御

3、素-4、6基因在不同時間點的表達水平，測序鑒定PCR產(chǎn)物的特異性。(3)乳鼠與成年鼠各一組，用大腸桿菌內(nèi)毒素腹腔注射兩組小鼠，于不同時間點處死小鼠，采用Trizol法提取肺組織總RNA，實時熒光定量PCR檢測肺組織beta-防御素-4、6基因在不同時間點的表達水平。(4)應(yīng)用SYBRGreenI熒光定量技術(shù)，利用GAPDH作參照，建立檢測hBD-3mRNA的實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄FQ-PCR方法，并檢測13份正常肺組織和16份肺癌組織標本h

4、BD-3mRNA的表達水平。 結(jié)果:(1)獲得預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物，經(jīng)序列鑒定證實為小鼠β防御素-6基因。(2)病理結(jié)果證實ALI動物模型復(fù)制成功。對照組肺組織中各時間點及ALI組6h點均無β-防御素-4、6基因表達。而ALI組12h、1d、3d時表達顯著升高。(3)小鼠β-防御素-4、6mRNA在LPS刺激12h后的幼鼠和成年鼠肺組織中均有表達，熒光定量證實乳鼠LPS刺激后不同時間點肺組織β-防御素-4、6mRNA的表達量低于

5、成年鼠，差異顯著(P＜0.01)。(4)hBD-3在肺癌和正常肺組織中的表達有明顯差別，說明肺癌組織中的hBD-3表達明顯高于正常肺組織，其表達量為正常肺組織的3.31倍。 結(jié)論:(1)獲得了小鼠β防御素-6基因，為進一步構(gòu)建表達載體，表達小鼠β防御素-6蛋白，獲取其基因工程產(chǎn)品及臨床抗感染治療打下了基礎(chǔ)，同時也為深入探討小鼠β防御素-6的作用機制提供可能。(2)ALI上調(diào)肺組織中β-防御素-4、6基因的表達；β-防御素-4、6

6、基因的誘導(dǎo)性表達可能通過參與“細胞網(wǎng)絡(luò)”和“細胞因子網(wǎng)絡(luò)”與ALI的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。(3)本實驗表明大腸桿菌內(nèi)毒素可以誘導(dǎo)β-防御素-4、6在乳鼠和成年鼠肺部表達，β防御素-4、6在乳鼠和成年鼠肺組織中表達差異顯著，說明此表達與小鼠年齡、發(fā)育有關(guān)。這些結(jié)果揭示當(dāng)乳鼠細胞免疫防御系統(tǒng)還不成熟時，乳鼠肺部的先天免疫屏障作用也低于成年鼠。提示乳鼠肺組織β-防御素-4、6的誘導(dǎo)表達量低下可能是乳鼠免疫反應(yīng)不成熟的部分表現(xiàn)。(4)建立的hBD-3m