小鼠胰腺腺泡細胞鈣振蕩研究：M受體去敏感化的時間依賴特點及2-APB和激光強度對鈣振蕩的影響.pdf

1、背景與目的：
　　副交感神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）可通過乙酰膽堿毒蕈堿受體（M受體，mAChRs）穩(wěn)定地激發(fā)胰腺腺泡細胞產(chǎn)生典型鈣振蕩（ACh-induced pancreatic acinar cell calcium oscillations，ACh-PACCOs）進而促進胰腺腺泡細胞的胰液分泌功能。胞內(nèi)鈣振蕩的動態(tài)變化可利用激光掃描共聚焦顯微鏡（laser scanning confocal mi

2、croscope，LSCM）或雙光子掃描共聚焦顯微鏡（two-photon laser scanning microscopy，TPLSM）實時記錄。本項目研究目的有三：一是以我們實驗室已經(jīng)建立的典型ACh-PACCOs反應(yīng)模型為基礎(chǔ)，通過精心設(shè)計的實驗方案，定量地研究小鼠胰腺腺泡細胞mAChRs被ACh激活后出現(xiàn)去敏感化的特點，以期對ACh-PACCOs有更全面的了解。二是在此基礎(chǔ)上，檢測藥物2-APB對ACh-PACCOs的影響。三

3、是檢測激光強度對ACh-PACCOs的影響，以期優(yōu)化實驗條件。
　　材料與方法：
　　1.小鼠胰腺腺泡細胞分離。4~6月齡昆明小鼠，經(jīng)乙醚麻醉，頸椎脫臼處死后迅速取出胰腺，用膠原酶液（150~200U/ml）處理后分離得到細胞懸液備用。
　　2. LSCM/TPLSM成像與灌流給藥記錄。取適量胰腺腺泡細胞懸液于載物盤上，待細胞貼壁后，避光負載鈣熒光染料Fluo-4-AM20 min；進而利用LSCM或TPLSM的二維連

4、續(xù)掃描模式（XYT）記錄ACh-PACCOs；相關(guān)藥物的影響根據(jù)實驗方案的要求通過灌流給藥裝置或微量噴藥裝置適時給予。
　　3.數(shù)據(jù)的分析處理。實驗設(shè)計以自身對照為主，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（?X±S）表示，采用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)分析，兩組間比較采用兩樣本T檢驗，多組比較時用單因素方差分析，曲線擬合用EXCEL軟件。P<0.05認為有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01認為差異顯著。
　　結(jié)果與結(jié)論：
　　1.

5、mAChRs的去敏感化研究：ACh-PACCOs可通過動態(tài)激光共聚焦鈣成像結(jié)合藥物灌流的方法實時直觀地記錄到，該反應(yīng)可被1?M的阿托品完全阻斷。在此基礎(chǔ)上進一步觀察到：如果延長ACh的作用時間，其所誘發(fā)的PACCOs會逐漸減弱，說明mAChRs被ACh激活后會產(chǎn)生去敏感化；在不同濃度（50~800nM）ACh的作用下，胞內(nèi)產(chǎn)生的鈣信號隨ACh濃度的增高而增強，mAChRs去敏感化程度越明顯（此為與孫娜娜同學(xué)論文中共同研究結(jié)果）。定量研究

6、發(fā)現(xiàn)：在一定時間范圍（0~6min）內(nèi)，mAChRs去敏感化的恢復(fù)程度與間隔時間呈線性關(guān)系，這提示ACh激活的mAChRs去敏感化在撤去ACh的作用后可隨時間逐漸減弱，mAChRs活性逐漸恢復(fù)，具有線性的時間依賴特點。雙光子成像結(jié)合微量噴藥的實驗結(jié)果也得到類似的結(jié)論。
　　2.2-APB對ACh-PACCOs的影響：多種實驗方案的結(jié)果都表明2-APB（10~100?M）可明顯改變ACh（100nM）-PACCOs的表現(xiàn)形式；統(tǒng)計發(fā)

7、現(xiàn)，2-APB在一定時間內(nèi)可使ACh-PACCOs的平均鈣釋放量明顯增大，頻率明顯降低，且這種效應(yīng)在一定范圍內(nèi)隨2-APB劑量增大而增強；但鈣釋放增強過后，細胞往往對ACh失去反應(yīng)能力，需過段時間才恢復(fù)。此現(xiàn)象可能與2-APB可阻斷鈣庫操縱性Ca2+內(nèi)流（store operated calcium entry，SOCE）有關(guān)。
　　3.激光強度對ACh-PACCOs的影響：結(jié)果顯示，與常用激光強度（一般3％）相比，加倍的激光強度