四分子交聯(lián)體5與大腸癌轉移的關系.pdf

1、大腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，嚴重威脅人類的生命健康。本研究用基因芯片技術篩選三株具有不同轉移潛能的結腸癌細胞株的差異表達基因，從中挑選出Tspan-5作為研究對象，從分子和細胞水平深入探討該基因對結腸癌細胞轉移能力的影響，旨在研究對大腸癌轉移相關基因，不僅有利于闡明大腸癌轉移的分子機制，而且還能為臨床上預測轉移、基因治療和預后判斷尋找新的有效靶點。 一、基因芯片技術篩選三株具不同轉移潛能的結腸癌細胞株的差異表達基因，確定研究目

2、的基因，驗證基因芯片檢查結果 1、確定三個細胞株轉移能力的差異用異質粘附實驗和趨化運動實驗確定LST-R1、SW480和Lovo三個細胞株之間轉移能力的差異。異質粘附實驗的粘附介質用collagenIV，細胞濃度為1×108／L，37℃、50mL／LCO2孵育1h。趨化運動實驗用8μm孔徑的transwell小室，趨化因子用NIH3T3細胞培養(yǎng)上清制備，調整細胞濃度為1×108／L，按200μL／上室加入細胞懸液，下室每室加50

3、0μLNIHSTS細胞培養(yǎng)上清，37℃、50mL/CO2孵育6h。結果顯示，LoVo、SW480和LST-R1三個細胞株基底膜粘附性有差異，F(xiàn)=84.279，P<0.001。其中，LST-R1粘附細胞數(shù)顯著少于LoVo(P<0.001)和SW480(P<0.001)，LoVo的粘附細胞數(shù)多于SW480(P<0.01)。粘附性強弱順序為LST-R1

4、。其中，LST-R1運動性弱于LoVo和SW480(P<0.001)，SW480運動性弱于LoVo(P<0.001)。運動性強弱順序為LST-R12或個<2而另個>10；信號值變異系數(shù)<0.33；信號平均值有2倍以上表達差異作為判定基因差異表達的標準。在顯著表達上調的基因中與轉移相關的基因主要有：發(fā)動蛋白

5、2(Dynamin2)、ADP-核糖基化因子1(ARF1)。在顯著下調表達的基因中，與轉移有關系的有跨膜4超家族成員9(transmenbrance4superfamily9，TM4SF9)，又稱四分子交聯(lián)體5(Tetraspan-5)。Tspan-5在結腸癌中的表達，為本研究首次報道，選擇該基因作為研究對象。 3、基因水平驗證基因芯片結果用半定量RT-PCR技術，結果顯示Tspan-5mRNA在三個細胞株中的表達水平差異與基因

6、芯片檢測結果相符。 4、蛋白水平驗證基因芯片結果細胞免疫化學技術定性，免疫印跡技術、免疫熒光技術結合流式細胞儀技術定量研究。結果顯示TSpan-5蛋白表達水平差異與基因芯片檢測結果相符。 5、臨床大腸癌組織樣本免疫組化研究：Tspan-5表達水平在正常大腸粘膜和息肉呈低表達或陰性，在有不典型增生的腺瘤組織中，Tspan-5表達相對于正常大腸粘膜和息肉開始升高，而在大腸癌組織中顯著升高，同時轉移癌的表達水平高于原發(fā)癌(Z=

7、109.859，P<0.001)。Tspan-5表達水平高的病人3年生存率低于Tspan-5表達水平低的病人(X2=6.237，P=0.013)。 二、體外實驗觀察改變Tspan-5表達水平對結腸癌細胞株轉移相關生物學行為的影響 1、克隆LoVo細胞Tspan-5基因，轉染LST-R1細胞，構建穩(wěn)定表達細胞系構建Tspan-5／pEGFP-C1重組質粒，用Lipofectamine2000TM.轉染入LST-R1細胞，同

8、時轉染pEGFP-C1質粒做對照。轉染后的LST-R1細胞在300μg／mLG418培養(yǎng)環(huán)境里穩(wěn)定存活。Western-Blot檢測顯示轉染Jspan-5／pEGFP-C1重組質粒的LST-R1中有Tspan-5-GFP融合蛋白表達，而轉染pEGFP-C1質粒的LST-R1細胞則無。激光共聚焦顯微鏡證明表達的Tspan-5GFP融合蛋白定位在細胞膜上，而GFP蛋白則定位在胞漿。 2、RNAi下調LoVo細胞Tspan-5表達設計

9、shRHA片段，構建質粒，用Lipofectamine2000TM導入LoVo細胞中，構建穩(wěn)定細胞系，干擾Tspan-5表達。免疫蛋白印跡檢測證明干擾成功，LoVoTspan5／453和LoVoTspan-5／372細胞Tspan-5蛋白表達水平顯著下降。選擇干擾效果最明顯的LoVoTspan5／453進行下一步研究。 3、異質粘附實驗實驗結果顯示：改變Tspan-5表達水平后，細胞基底膜主要成份CollagenIV、FN、LN

10、、VN粘附能力均發(fā)生改變，上調Tspan-5表達可增強細胞基底膜粘附性，下調Tspan-5表達則降低細胞的基底膜粘附性，其中改變Tspan-5表達水平對CollagenIV的粘附能力降低最明顯。 4、趨化運動實驗實驗結果顯示：改變Tspan-5表達水平后，細胞CollagenIV、FN、LN、VN趨化運動能力均發(fā)生改變，以CollagenIV為明顯。上調Tspan-5表達可增強細胞運動性，下調Tspan-5表達則降低細胞的運動性

11、。 5、劃痕實驗實驗結果顯示：改變Tspan-5表達水平后，大腸癌細胞在CollagenIV上的劃痕愈合能力發(fā)生改變，下調Tspan-5表達可顯著抑制大腸癌細胞在CollagenIV上的劃痕愈合能力。 三、整合素與Tspan-5的相互作用 l、整合素功能阻斷和激活單獨阻斷整合素β1和Tspan-5表達，LoVo細胞的CollagenIV粘附能力下降分別為65％和55％，聯(lián)合阻斷后，LoVo細胞的CollagenI

12、V粘附能力下降64％：單獨激活整合素β1表達，LoVo細胞的CollagenIV粘附能力上升40％，激活已阻斷Tspan-5表達的LoVo細胞，其CollagenIV粘附能力上升38％。聯(lián)合阻斷Tspan-5和整合素β1，其抑制LoVo細胞的CollagenIV粘附能力的作用沒有明顯疊加；阻斷Tspan-5的表達，對激活整合素β1的LoVo的CollagenIV粘附能力無明顯影響。此研究結果提示，Tspan-5對大腸癌細胞的Collag

13、enIV粘附能力的主要與整合素β1有關。 2、Western-Blot敲低Tspan-5表達對整合素β1的表達無顯著影響，但可以顯著抑制PIP2的表達。 3、免疫共沉淀大腸癌細胞株LoVo和SW620中，整合素β1可以被Tspan-5抗體沉淀。 4、免疫熒光雙染色Tspan-5和整合素β1在大腸癌細胞株LoVo和SW620中存在共定位。 四、體內實驗觀察Tspan-5敲除對大腸癌細胞裸鼠肝轉移能力的影響脾

14、臟保留法建立裸小鼠肝臟轉移模型，用LoVoTspan-5／N和LoVoTspan-5／453細胞，3周處死小鼠，HE染色，光鏡下見癌細胞呈團塊狀分布，無腺腔樣結構，胞漿豐富，核大不規(guī)則，核仁明顯，可見多核瘤巨細胞，核分裂像易見，符合低分化腺癌的結構特征(圖3-9)。雖然敲除Tspan-5表達未能阻止轉移發(fā)生，但是LoVoTspan-5／453組肝臟表面結節(jié)數(shù)低于LoVoTspan05／N(Z=-2.259，P<0.001) 通過

15、以上研究可以得出以下結論： 1、LST-R1、SW480及LoVo細胞株具有不同轉移潛能，LoVo>SW480>LST-R1。 2、LST-R1、SW480、LoVo細胞Tspan-5表達水平有差異，LoVo>SW480>LST-R1。 3、Tspan-5的表達水平與大腸癌的進展呈正相關，Tspan-5表達高的病人3年生存率低于Tspan-5表達水平低的病人； 4、改變Tspan-5表達水平可以改變結腸癌