Toll樣受體4基因干預(yù)抑制動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)。研究表明，伴有免疫反應(yīng)的炎癥過程貫穿于動(dòng)脈粥樣硬化的始終。炎性細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化病變的進(jìn)程中扮演了重要角色。血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及外膜的成纖維細(xì)胞和肥大細(xì)胞均可作為免疫細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子。但在動(dòng)脈粥樣硬化疾病的發(fā)生和發(fā)展中，對其發(fā)病分子機(jī)制至今尚未闡明。近年來認(rèn)為免疫應(yīng)答，在AS的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，特別是晚近對天然免疫在AS中的

2、作用的研究成為新的研究熱點(diǎn)。已知人類具有天然和獲得性兩個(gè)免疫識別系統(tǒng)來抵御潛在的有害物質(zhì)。獲得性免疫系統(tǒng)特異性識別環(huán)境中存在的獨(dú)特抗原決定簇。天然免疫是機(jī)體抵御微生物的第一道屏障，識別被稱為病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattems,PAMP)的高度保守抗原域。Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)識別種類繁多的PAMP，屬于模式識別受體。目前為止，人類TLR家族

3、至少有10名成員已被發(fā)現(xiàn)。不同的PAMP活化人類TLR家族的不同成員。TLR通過與內(nèi)、外源性配體結(jié)合，激發(fā)天然免疫和獲得性免疫應(yīng)答，啟動(dòng)促炎因子的釋放，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生，在炎癥反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中發(fā)揮極其重要的作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：TLR調(diào)控膽固醇代謝、炎癥和免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、斑塊穩(wěn)定性以及血管重塑等病理過程，而這些貫穿于AS病程始終。因此，本研究認(rèn)為TLR將為動(dòng)脈粥樣硬化疾病的治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)。 雖然近年來國內(nèi)外學(xué)者在TLR

4、4與AS的相互關(guān)系研究中已取得很大的進(jìn)展但仍存在許多重大問題亟待解決：①既然TLR在AS形成和斑塊破裂中扮演重要角色，而動(dòng)脈粥樣硬化斑塊病變處的巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞以表達(dá)TLR4為主，能否通過封閉TLR4基因表達(dá)阻止AS進(jìn)程并降低AS斑塊的易損性。這構(gòu)成本課題的主導(dǎo)思想。②目前造成基因失活的方式主要有反義寡核苷酸技術(shù)、核酶或核酸技術(shù)、三鏈DNA技術(shù)、單克隆抗體等。反義技術(shù)雖能抑制“有害”基因的表達(dá)而造成基因失活，但由于反義RNA的選擇設(shè)計(jì)

5、難度較大、反義RNA與mRNA的親和力及其結(jié)合的特異性受到結(jié)合位點(diǎn)兩側(cè)序列的二級或三級結(jié)構(gòu)的影響、反義寡核苷酸的多聚陰離子性質(zhì)會(huì)引起一系列副作用等問題，故反義RNA目前只應(yīng)用于惡性腫瘤、病毒感染等疾病。三鏈DNA技術(shù)是將脫氧寡核苷酸與雙螺旋雙鏈DNA專一性序列結(jié)合形成三鏈DNA，達(dá)到阻止基因轉(zhuǎn)錄或DNA復(fù)制的目的，此脫氧寡核苷酸稱為三鏈DNA形成脫氧寡核苷酸(TFO)，這一技術(shù)存在穩(wěn)定性差、半衰期短的缺點(diǎn)，而且TFO必須與同聚嘌呤同聚嘧

6、啶片段結(jié)合，而這樣的DNA片段在真核細(xì)胞中很少。同樣，利用單克隆抗體封閉治療亦存在半衰期短等缺點(diǎn)。能否找尋一種有效的方法對基因進(jìn)行干預(yù)。③針對TLR4的基因干預(yù)與藥物治療誰能在炎性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和斑塊易損性中起“閘門”作用，它們各自的機(jī)制如何?因此，本課題率先開展了封閉TLR4基因阻止AS進(jìn)程，穩(wěn)定易損斑塊的機(jī)制研究，并取得了一定研究成果。目的1．建立TLR4基因RNA干擾載體并轉(zhuǎn)染細(xì)胞篩選陽性克隆細(xì)胞； 2．體外對比研究TLR4

7、-RNAi與阿托伐他汀藥物干預(yù)抑制TLR4基因繼而引起細(xì)胞生物學(xué)行為和相關(guān)基因的表達(dá)變化，并探討其機(jī)制； 3．體外對比觀察TLR4-RNAi與阿托伐他汀藥物對TLR4信號通路誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的作用，為在體研究提供分子生物學(xué)依據(jù)； 4．動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對比研究RNAi與藥物封閉TLR4基因?qū)ψ柚笰S進(jìn)程，降低動(dòng)脈粥樣硬化斑塊易損性的作用機(jī)制并評估其治療效果。 方法 1.RNA小分子干擾表達(dá)載體的構(gòu)建篩選1．1有效封閉T

8、LR4表達(dá)的小分子干擾RNA載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)、合成兩對特異性針對TLR4基因的小分子干擾RNA序列，同時(shí)設(shè)計(jì)與人類所有已知基因序列均無同源性的片段作為陰性對照，以pRNAT-U6.1neo為母本，分別構(gòu)建小分子干擾RNA載體pRNAT-TLR4-1、pRNAT-TLR4-2及對照載pRNAT-Neg，DNA序列測定鑒定重組質(zhì)粒的正確性。 1．2陽性細(xì)胞克隆篩選質(zhì)粒經(jīng)陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)分別轉(zhuǎn)染處于對數(shù)生長期的ECV304細(xì)胞，利用含G418的

9、DMEM培養(yǎng)液篩選陽性克隆。根據(jù)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的不同，分別命名為ECV304-pTLR4-1，ECV304-pTLR4-2，ECV304-pNeg細(xì)胞。 1．3有效封閉TLR4表達(dá)的小分子干擾RNA載體的篩選收集穩(wěn)定篩選獲得的ECV304-pTLR4-1，ECV304-pTLR4-2，ECV304-pNeg及ECV304對照細(xì)胞。熒光定量RT-PCR、Western blot分別檢測各轉(zhuǎn)染細(xì)胞TLR4mRNA水平、蛋白質(zhì)水平的表達(dá)，篩

10、選有效阻斷TLR4表達(dá)的小分子干擾RNA載體。 2．體外對比研究RNAi與阿托伐他汀抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)的TLR4表達(dá)的機(jī)制及逆轉(zhuǎn)炎癥反應(yīng)的效應(yīng)2．1將細(xì)胞隨機(jī)分成下列4組進(jìn)行干預(yù)：對照組、LPS組、LPS+RNAi組及LPs+阿托伐他汀組；觀察各組TLR4基因和蛋白的表達(dá)變化，以及引起NF-rd3信號通路蛋白的變化，初步探討基因干預(yù)與阿托伐他汀引起其變化機(jī)制的異同。 2．2將LPS+RNAi組、LPS+阿托伐他汀組選擇性加入

11、NF-KB抑制劑(SN50)、P13K抑制劑(Ly294002)、ERK抑制劑(PD98059)和P38抑制劑(SB203580)，深入探討基因治療與藥物干預(yù)調(diào)節(jié)NF-KB的內(nèi)在分子機(jī)制的的異同。 2．3將細(xì)胞隨機(jī)分成下列4組進(jìn)行干預(yù)：對照組、LPS組、LPS+RNAi組、及LPS+阿托伐他汀組；觀察不同方法(RNAi與阿托伐他汀)抑制TLR4基因與下游效應(yīng)因子IL-6(Ta-2細(xì)胞因子)及IL-10(促使T細(xì)胞向T調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育

12、)產(chǎn)生的關(guān)系。同時(shí)觀察兩種不同干預(yù)與炎性因子TNFa產(chǎn)生的關(guān)系。以次探討比較基因治療與藥物干預(yù)對TLR4誘導(dǎo)免疫反應(yīng)與炎癥反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)。 3．動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對比研究RNAi與藥物封閉TLR4基因?qū)ψ柚笰S進(jìn)程，穩(wěn)定AS斑塊易損性的作用機(jī)制并評估其治療效果3．1小分子干擾腺病毒載體的體外擴(kuò)增、滴度測定及體外活性檢測pSuppressorAd-TLR4，pSuppressorAd-Neg腺病毒感染HEK293細(xì)胞，72h后出現(xiàn)明顯細(xì)胞病

13、變，分別收集培養(yǎng)上清和細(xì)胞。反復(fù)凍融裂解細(xì)胞，收集病毒顆粒。低熔點(diǎn)瓊脂糖空斑形成試驗(yàn)測定病毒滴度，并將其作用于小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，熒光定量檢測TLR4mRNA表達(dá)。 3.2 RNAi基因治療與阿托伐他汀藥物治療ApoE-/-小鼠的實(shí)驗(yàn)研究： 8周齡ApoE-/-小鼠，予西方飲食(含21﹪脂肪和0.15﹪膽固醇)和SPF級飼養(yǎng)10周，并隨機(jī)分為下列4組(n=27)對照載體組、RNAi組、安慰劑組和阿托伐他汀組。對照載體組

14、：先單純高脂喂養(yǎng)5周。于五周末將小分子干擾腺病毒Ad-siRNA-Neg經(jīng)尾靜脈注射至小鼠體內(nèi)，繼續(xù)高脂喂養(yǎng)5周。RNAi組：先單純高脂喂養(yǎng)5周。于五周末將小分子干擾腺病毒Ad-siRNA-TLR4經(jīng)尾靜脈注射至小鼠體內(nèi)，繼續(xù)高脂喂養(yǎng)5周。安慰劑組：將安慰劑溶于超純水灌胃10周。阿托伐他汀組：將阿托伐他汀(10mg/kg/d)溶于超純水灌胃10周。干預(yù)10周后處死動(dòng)物，頸靜脈取血檢測血膽固醇、甘油三酯、LDL和HDL(禁食8h)。