體外培養(yǎng)的小鼠骨髓源性未成熟樹突狀細胞對小鼠同種異體移植心存活時間影響的實驗研究.pdf

1、20世紀以來，隨著器官移植技術(shù)，移植免疫基礎(chǔ)以及各種免疫抑制劑的研究進展，心臟移植已成為治療終末期心臟病的有效手段。但是，由于急慢性排斥反應(yīng)造成的移植心臟功能障礙仍是影響療效的主要原因。而且，盡管現(xiàn)行的免疫抑制劑能在一定程度上控制排斥反應(yīng)，但這些免疫抑制劑幾乎無一例外的對受體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生非特異性的廣泛抑制，由此引起的感染，繼發(fā)腫瘤以及終身帶藥的巨額費用嚴重影響著移植病人的生存質(zhì)量。因此，誘導供體特異性的免疫耐受被認為是最終克服免疫排斥，

2、提高受者生存質(zhì)量的有效途徑。 排斥反應(yīng)的實質(zhì)是機體對異體抗原的免疫應(yīng)答反應(yīng)，這是一個極其復(fù)雜的過程，涉及多種免疫細胞和免疫分子的相互作用。樹突狀細胞(dendriticcell，DC)是一種最為重要的專職抗原提呈細胞(antigenpresentingcell，APC)，是唯一能夠激活初始T細胞的APC。隨著對其在免疫反應(yīng)中作用機制的闡明，人們發(fā)現(xiàn)DC處于抗原提呈過程的中心環(huán)節(jié)，在移植免疫中起雙向作用。一方面，DC向受體T細胞提

3、呈供體抗原并提供活化信號，啟動排斥反應(yīng)的發(fā)生，另一方面，某些DC具有免疫調(diào)節(jié)作用，在誘導和維持自體和外來抗原的免疫耐受中發(fā)揮重要作用。因此，利用DC的免疫調(diào)節(jié)作用誘導供體特異性的免疫耐受已成為當前移植領(lǐng)域的研究熱點之一。 最近，有研究表明DC的功能與其細胞成熟狀態(tài)有關(guān)，成熟DC啟動免疫反應(yīng)，而未成熟DC傾向誘導免疫耐受。本研究在低濃度粒巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的條件下體外培養(yǎng)擴增小鼠骨髓源性未成熟DC，對其細胞形態(tài)、

4、表型及體外生物學特性進行了觀察和檢測，并觀察將其通過不同的途徑、不同的方式輸入受體對小鼠同種異體移植心臟存活時間的影響，并初步探討其發(fā)生機制。本研究分為以下四部分： 第一部分應(yīng)用cuff技術(shù)建立小鼠頸部異位心臟移植模型 本部分我們運用cuff技術(shù)建立了簡單易行、穩(wěn)定可靠的小鼠頸部異位心臟移植模型并對其進行觀察，為進一步進行移植免疫學研究作基礎(chǔ)。實驗分為同種異體移植組(n=15)和同系移植組(n=10)，同種異體移植采用雜

5、交昆明小鼠，同系移植在近交系BALB/c小鼠間進行，共進行正式移植手術(shù)25次。用硬膜外麻醉導管自制血管套管用于手術(shù)，動脈端套管外徑0.6mm，內(nèi)徑0.4mm。手術(shù)在10倍手術(shù)顯微鏡下單人操作完成，采用供受體交替手術(shù)的方式縮短供心缺血時間，先準備受體的動脈、靜脈套管，然后切取供心，運用cuff技術(shù)將受體頸總動脈和頸外靜脈相應(yīng)與供心的主動脈和肺動脈吻合。結(jié)果顯示：25次正式手術(shù)，術(shù)后復(fù)跳率為100％，2例于術(shù)后第1天死亡，3天存活率為92％

6、，供心缺血時間均少于30分鐘。同種異體移植心存活時間平均為8天左右，病理檢查可見典型的排斥反應(yīng)征象，同系移植心可長期存活，病理檢查未見明顯心肌損害。 第二部分低劑量GM-CSF培養(yǎng)小鼠骨髓源性未成熟樹突狀細胞的實驗研究本部分建立了小鼠骨髓源性未成熟DC的培養(yǎng)方法，并初步觀察其生物學特性。無菌條件下分離小鼠的骨髓細胞，用紅細胞裂解液去除紅細胞后，用RMPI1640全培養(yǎng)液按2×106/ml的密度進行培養(yǎng)，按加入細胞因子GM-CSF

7、的劑量分為常規(guī)劑量組(200U/ml)和低劑量組(50U/ml)，每3天換液1次，培養(yǎng)時間為12天，并加入脂多糖(LPS)觀察其對各組DC的促成熟作用。光鏡下對其進行形態(tài)學觀察，用流式細胞術(shù)進行細胞鑒定并檢測細胞表型，混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)檢測其在體外刺激同種異體T細胞增殖的能力，并比較不同劑量GM-CSF下培養(yǎng)細胞內(nèi)IL-10和TGF-βmRNA的表達水平。結(jié)果顯示：常規(guī)劑量GM-CSF培養(yǎng)出的DC為成熟DC和未成熟DC的混合體，

8、經(jīng)LPS刺激后可迅速分化成熟，表型為CD11c+，CD25±，CD80+，CD86+，MHCⅡhi，在體外可強烈刺激同種異體T細胞分化增殖；而低劑量GM-CSF培養(yǎng)出的DC為較單純的未成熟DC，表型為CD11c+，CD25-，CD80-，CD86-，MHCⅡlow，加入LPS刺激后細胞表型無明顯變化，MLR提示不能有效刺激活化同種異體T細胞增殖，其IL-10mRNA表達水平明顯高于其他細胞，TGF-βmRNA在幾組細胞中的表達無明顯差異

9、。 第三部分術(shù)前輸注體外培養(yǎng)的供體未成熟樹突狀細胞對移植心存活時間影響的實驗研究 本部分觀察用低劑量GM-CSF培養(yǎng)的小鼠骨髓源性未成熟DC術(shù)前輸注對同種異體移植心存活時間的影響。36只C57小鼠隨機分為4組，每組9只，術(shù)前將用低劑量GM-CSF的方法培養(yǎng)BALB/c小鼠骨髓源性未成熟DC約1.0×106個分別經(jīng)尾靜脈(imDCiv組)和門靜脈(imDCpv組)輸注C57小鼠體內(nèi)，對照組分別經(jīng)尾靜脈(NSiv組)和門靜脈

10、(NSiv組)注入生理鹽水，7天后行BALB/c→C57同種異體心臟移植。移植后7天，每組隨機取3只小鼠處死，用半定量RT-PCR方法檢測各組小鼠脾細胞Th1型細胞因子(INF-γ和IL-12)和Th2型細胞因子(IL-4和IL-10)mRNA的表達水平，移植心做病理檢查觀察排斥反應(yīng)程度，剩余小鼠觀察移植心存活時間。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)進行微嵌合現(xiàn)象的檢測，將雄性BALB/c小鼠骨髓源性未成熟DC分別經(jīng)尾靜脈和門靜脈輸注雌性C57小鼠體

11、內(nèi)，分別于輸注后7天，14天和21天用檢測H-YmRNA的方法觀察供體源性DC在受體體內(nèi)的存活情況。結(jié)果顯示：imDCiv組和imDCpv組移植心存活時間均顯著長于相應(yīng)對照組(分別為14.3±1.9dvs6.3±1.2d和22.7±5.7dvs7.5±1.6dP＜0.01)，且imDCpv組的移植心存活時間又明顯長于imDCiv組(P＜0.01)。移植后7天imDCiv組和imDCpv組小鼠脾細胞Th1型細胞因子mRNA表達較對照組低，

12、而Th2型細胞因子mRNA表達較對照組高；移植心病理切片顯示：imDCiv組和imDCpv組第7天時移植心出現(xiàn)輕度排斥反應(yīng)(Stanford1～2級)，而對照組NSiv組和NSiv組移植心出現(xiàn)嚴重排斥反應(yīng)(Stanford3～4級)。微嵌合檢測表明供體未成熟DC經(jīng)門靜脈輸入受體21天后仍可檢測到供體H-YmRNA，而經(jīng)尾靜脈輸入則在第14天已幾乎檢測不到供體H-YmRNA。 第四部分術(shù)前輸注負載供體抗原的受體未成熟樹突狀細胞對移

13、植心存活時間影響的實驗研究 本部分利用負載供體抗原的受體未成熟DC干擾T細胞的抗原間接識別途徑，并觀察其對同種異體移植心存活時間的影響。分別用低劑量和常規(guī)劑量GM-CSF培養(yǎng)受體小鼠骨髓源性未成熟DC和成熟DC，并在培養(yǎng)過程中加入供體可溶性抗原共同孵育，流式細胞術(shù)檢測細胞表型，觀察負載供體抗原對受體DC協(xié)同刺激分子表達的影響，并用混合淋巴細胞反應(yīng)(MLR)檢測負載供體抗原的受體DC對自身T細胞的刺激活化作用。將負載供體抗原的受體

14、未成熟DC約2.0×106個于術(shù)前7天輸注受體體內(nèi)，觀察其對同種異體移植心存活時間的影響。用再次MLR的方法檢測輸注負載供體抗原的受體未成熟DC7天后，受體小鼠脾細胞對自身抗原，供體抗原及無關(guān)抗原刺激的反應(yīng)增殖能力。結(jié)果顯示：在受體DC培養(yǎng)過程中加入供體可溶性抗原對DC的細胞表型無明顯影響，與供體抗原共同孵育的受體成熟DC可明顯刺激自體T細胞活化增殖，說明可以通過共同孵育的方式使受體DC有效負載供體抗原。負載供體抗原的受體未成熟DC在體

15、外不能有效刺激自體T細胞活化增殖，將其于術(shù)前輸注受體體內(nèi)，移植心的存活時間由7.2±1.7d延長至17.7±3.3d。再次MLR的結(jié)果表明，輸注負載供體抗原的受體未成熟DC7天后，受體小鼠脾細胞對供體抗原刺激呈低反應(yīng)狀態(tài)，而對無關(guān)抗原刺激反應(yīng)正常。 結(jié)論1.應(yīng)用cuff技術(shù)建立小鼠異位心臟移植模型，明顯降低了手術(shù)難度，具有手術(shù)創(chuàng)傷小，供心缺血時間短，成功率高的優(yōu)點，是一種簡單實用的方法。 2.用低劑量GM-CSF可培養(yǎng)出

16、性質(zhì)相對穩(wěn)定的未成熟的小鼠骨髓源性DC，表現(xiàn)為低水平表達MHCⅡ分子，不表達協(xié)同刺激分子CD80和CD86，LPS不能刺激其分化成熟，在體外不能有效刺激同種異體T細胞增殖。其高水平表達IL-10mRNA提示可能高水平分泌IL-10，可能是其成熟障礙的原因。 3.術(shù)前輸注用低劑量GM-CSF培養(yǎng)出的供體未成熟骨髓源性DC，可明顯延長移植心的存活時間，可能與誘導受體Th1/Th2免疫偏移有關(guān)。 4.經(jīng)門靜脈輸入供體未成熟DC