pCD86-RAE-1ε轉(zhuǎn)基因小鼠CD4+NKG2D+T細(xì)胞的生物學(xué)特性研究.pdf

1、樹突狀細(xì)胞(DC)作為機(jī)體重要的一種專職抗原遞呈細(xì)胞(APC)，能有效活化初始T細(xì)胞。NK細(xì)胞可通過其表面NKG2D受體結(jié)合表達(dá)于DC表面的NKG2D配體。NK-DC之間的對(duì)話不僅影響天然免疫的功能，對(duì)獲得性免疫的形成、發(fā)展及結(jié)果有深遠(yuǎn)的影響。為研究DC持續(xù)表達(dá)NKG2D配體對(duì)NK細(xì)胞免疫功能的影響，課題組前期制備了pCD86∶RAE-1ε轉(zhuǎn)基因小鼠，并完成轉(zhuǎn)基因小鼠的篩選鑒定與免疫功能的初步分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞表面NKG2

2、D下調(diào)、免疫功能低下的同時(shí)，CD4+T細(xì)胞表面NKG2D表達(dá)上調(diào)。本研究擬進(jìn)一步探討轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞表面NKG2D下調(diào)的機(jī)制，并對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)異常增多的CD4+NKG2D+T細(xì)胞亞群的功能及其表型特征進(jìn)行深入研究。
　　研究?jī)?nèi)容分為2部分:
　　1.pCD86∶RAE-1ε轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)NKG2D介導(dǎo)的NK細(xì)胞功能分析
　　目的:觀察pCD86∶RAE-1ε轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)NKG2D介導(dǎo)的免疫功能變化，探討體內(nèi)N

3、K細(xì)胞NKG2D表達(dá)下調(diào)的機(jī)制。
　　方法:首先利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠的肝、腎、胸腺、肺、腸等組織中I-A/I-E細(xì)胞表達(dá)RAE-1ε的情況，基于流式細(xì)胞術(shù)分析轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟內(nèi)各免疫細(xì)胞表面RAE-1ε的表達(dá)。其次分析轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟NK細(xì)胞的頻率及其NKG2D表達(dá)的情況，利用CD107a標(biāo)記法檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)Ba/F3、Ba/F3-RAE細(xì)胞的殺傷活性;并體內(nèi)觀察轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)B16BL6-MICA、B16BL6細(xì)胞生長(zhǎng)的情

4、況，右旋葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)腸炎發(fā)病的情況。另外，體外將轉(zhuǎn)基因小鼠DC細(xì)胞、血清分別與正常小鼠NK細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察NK細(xì)胞表面NKG2D表達(dá)的變化。最后檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠CD4+T、CD4+NKG2D+T細(xì)胞的頻率，觀察CD4+NKG2D+T細(xì)胞膜表面是否表達(dá)TGF-β，并將CD4+NKG2D+T細(xì)胞與正常小鼠NK細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測(cè)NK細(xì)胞NKG2D的表達(dá)。
　　結(jié)果:轉(zhuǎn)基因小鼠胸腺、腸道組織、肝臟內(nèi)檢測(cè)到I-A/I-E與RAE-

5、1ε共表達(dá)的細(xì)胞，脾臟CD11c+、CD11b+、CD19+、Gr-1+細(xì)胞上調(diào)RAE-1ε的表達(dá)，而NK1.1+、CD3+細(xì)胞無RAE-1ε的表達(dá)。與對(duì)照小鼠相比，轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟NK細(xì)胞的頻率無明顯變化，但NKG2D表達(dá)下調(diào)至中等程度水平，NK細(xì)胞殺傷Ba/F3-RAE細(xì)胞的活性下降，而殺傷Ba/F3細(xì)胞的能力無明顯變化。轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)B16-MICA細(xì)胞的生長(zhǎng)速度快于對(duì)照小鼠，而B16細(xì)胞的生長(zhǎng)速度在2種小鼠間無明顯區(qū)別。DSS處理

6、的轉(zhuǎn)基因小鼠延緩了腸炎的發(fā)病。轉(zhuǎn)基因小鼠來源的DC細(xì)胞體外刺激NK細(xì)胞5天后，上調(diào)NK細(xì)胞功能，而對(duì)NKG2D的表達(dá)無明顯影響。轉(zhuǎn)基因小鼠來源的血清對(duì)NK細(xì)胞表達(dá)NKG2D無影響。轉(zhuǎn)基因小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞頻率無明顯變化，而CD4+NKG2D+T細(xì)胞的頻率明顯上調(diào)。CD4+NKG2D+T細(xì)胞膜表面表達(dá)TGF-β，與NK細(xì)胞共培養(yǎng)后下調(diào)NKG2D的表達(dá)。
　　結(jié)論:pCD86∶RAE-1ε轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)出現(xiàn)異常增多的CD4+NKG

7、2D+T細(xì)胞，其分泌TGF-β介導(dǎo)NK細(xì)胞下調(diào)表達(dá)NKG2D，并下調(diào)NKG2D介導(dǎo)的免疫功能。
　　2.pCD86∶RAE-1ε轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)CD4+NKG2D+T細(xì)胞的生物學(xué)特性研究
　　目的:深入分析CD4+NKG2D+T細(xì)胞的效應(yīng)功能及表型特點(diǎn)，探討CD4+NKG2D+T細(xì)胞體外和體內(nèi)的誘生機(jī)制，并初步鑒別CD4+NKG2D+T細(xì)胞與經(jīng)典調(diào)節(jié)型T細(xì)胞(Treg)、Th17細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)。
　　方法:首先觀察正常

8、小鼠CD4+T細(xì)胞過繼輸入至小鼠體內(nèi)，其細(xì)胞表面NKG2D表達(dá)的變化。其次，通過胞內(nèi)細(xì)胞因子法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠、CT-26細(xì)胞荷瘤小鼠、對(duì)照小鼠體內(nèi)CD4+NKG2D+T細(xì)胞分泌IL-10、TGF-β、FasL、IFN-γ的情況;并將CD4+NKG2D+T細(xì)胞與CD4+NKG2DT細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察其抑制效應(yīng)性T細(xì)胞增殖的情況;觀察CD4+NKG2D+T細(xì)胞胞漿內(nèi)顆粒酶B、穿孔素的表達(dá)，及其殺傷靶細(xì)胞活性。另外，檢

9、測(cè)CD4+NKG2D+T細(xì)胞表面CD44、CD62L的表達(dá)分析該細(xì)胞的活化狀態(tài)，檢測(cè)其表面CD69、CD127、CD25、I-A/I-E、NKG2DL、CD28、CD152的表達(dá)。基于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，觀察不同刺激劑誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞表面NKG2D的表達(dá)，并觀察不同刺激劑對(duì)CD4+NKG2D+T細(xì)胞分裂的影響;基于小鼠體內(nèi)B16-MICA、B16細(xì)胞荷瘤實(shí)驗(yàn)，體內(nèi)觀察腫瘤細(xì)胞表面MICA的表達(dá)對(duì)CD4+NKG2D+T細(xì)胞的影響。最后檢測(cè)CD

10、4+NKG2D+T細(xì)胞表達(dá)Foxp3、CD223、CD39，分泌IL-17A和RORγt的轉(zhuǎn)錄情況，以與Treg和Th17細(xì)胞相鑒別。
　　結(jié)果:正常小鼠CD4+T細(xì)胞輸入轉(zhuǎn)基因小鼠后，明顯上調(diào)了NKG2D的表達(dá)。轉(zhuǎn)基因小鼠、CT-26荷瘤小鼠體內(nèi)的CD4+NKG2D+T細(xì)胞表達(dá)FasL、高分泌TGF-β、IL-10，體外可抑制CD4+NKG2D-T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞增殖，胞漿內(nèi)無顆粒酶、穿孔素分泌，無細(xì)胞毒活性，低分泌IFN-

11、γ。CD4+NKG2D+T細(xì)胞以效應(yīng)記憶型細(xì)胞為主，高表達(dá)CD69、CD25、I-A/I-E、NKG2DL等活化分子。NKG2D在CD4+T細(xì)胞的誘導(dǎo)表達(dá)主要與TCR-CD3信號(hào)及NKG2DL的持續(xù)刺激有關(guān)，MICA陽性腫瘤細(xì)胞荷瘤小鼠體內(nèi)CD4+NKG2D+T細(xì)胞的頻率明顯高于MICA陰性腫瘤細(xì)胞荷瘤小鼠。CD4+NKG2D+T細(xì)胞胞漿內(nèi)無Foxp3轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞表面無CD223表達(dá)，高水平表達(dá)CD39分子。另外，CD4+NKG2D+T細(xì)