Tau-APP-PS1三重轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立及生物學(xué)研究.pdf

1、神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFT)和老年斑(SP)是阿爾茨海默病(AD)的兩個(gè)典型的病理改變，本實(shí)驗(yàn)研究的目標(biāo)是建立具有老年斑和神經(jīng)元纖維纏結(jié)兩種病理改變的轉(zhuǎn)基因小鼠，為AD的病理機(jī)制研究和藥物開(kāi)發(fā)提供理想的動(dòng)物模型。
　　 本實(shí)驗(yàn)室的前期實(shí)驗(yàn)是將帶有小鼠特異性的神經(jīng)元啟動(dòng)子Thy-1和含有P301L突變的人最長(zhǎng)Tau蛋白的異構(gòu)體通過(guò)雄原核顯微注射法，轉(zhuǎn)入FVB小鼠受精卵中建立Tau轉(zhuǎn)基因小鼠模型；檢測(cè)Tau轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)具有外源性Tau

2、蛋白表達(dá)，將含P301L突變的Tau轉(zhuǎn)基因鼠傳至第5代；并通過(guò)了行為學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Tau轉(zhuǎn)基因小鼠在6月時(shí)具有行為學(xué)改變，9月齡時(shí)發(fā)現(xiàn)海馬和皮層出現(xiàn)NFT。
　　 本課題是在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將自行建立的表達(dá)NFT的Tau轉(zhuǎn)基因小鼠與從Jackson實(shí)驗(yàn)室引種的表達(dá)Aβ蛋白的APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，應(yīng)用PCR篩選含有外源基因的子代鼠；采用RT-PCR和Western-blot檢測(cè)外源基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)；通過(guò)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)和病理學(xué)研究

3、其生物學(xué)特性。
　　 雜交小鼠已繁殖兩代。F1代，共16窩，生仔97只。經(jīng)PCR檢測(cè)出現(xiàn)4種不同轉(zhuǎn)基因小鼠類(lèi)型，分別為：①含有Tau、APP、PS1的Tau/APP/PS1三重轉(zhuǎn)基因小鼠，陽(yáng)性率為42.26％；②含有APP和PS1基因的APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠，陽(yáng)性率為5.15％；③含有Tau基因的Tau轉(zhuǎn)基因小鼠，陽(yáng)性率為49.48％；④無(wú)外源基因的野生型小鼠有3.12％。將Tau/APP/PS1三重轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠進(jìn)行種內(nèi)繁殖

4、得到第F2代，共62只，其中Tau/APP/PS1三轉(zhuǎn)重轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率為54.83％，APP/PS1轉(zhuǎn)基小鼠陽(yáng)性率為12.9％，Tau轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率為16.15％，野生型小鼠16.12％。F2代Tau/APP/PS1三重轉(zhuǎn)基因小鼠陽(yáng)性率高于F1代，結(jié)果有顯著性的差異，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示雜交繁殖可得到Tau/APP/PS1三重轉(zhuǎn)基因小鼠，并已傳至F2代。Tau基因和APP/PS1基因不在同一染色體上。
　　 用RT-PCR、we

5、stern-blot、銀染、免疫組化和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)對(duì)雜交所得到的野生型小鼠(Wt)、Tau轉(zhuǎn)基因小鼠(Tau)、APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠(APP/PS1)和Tau/APP/PS1三重轉(zhuǎn)基因小鼠(Tau/APP/PS1)進(jìn)行了生物學(xué)研究。
　　 RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型小鼠沒(méi)有外源基因的轉(zhuǎn)錄，Tau轉(zhuǎn)基因小鼠有Tau基因轉(zhuǎn)錄，APP/PS1小鼠有APP和PS1基因轉(zhuǎn)錄。Tau/APP/PS1則有APP、PS1和Ta

6、u基因的轉(zhuǎn)錄。提示雜交所得轉(zhuǎn)基因小鼠的外源基因可以在大腦正常轉(zhuǎn)錄。
　　 Western-Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠大腦海馬和皮層區(qū)外源Tau蛋白和Aβ蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)3、6、9月齡Tau轉(zhuǎn)基因小鼠和Tau/APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠均有Tau蛋白表達(dá)，APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠及Tau/APP/PS1三重轉(zhuǎn)基因小鼠有Aβ蛋白的表達(dá)。3月齡的APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠及Tau/APP/PS1三重轉(zhuǎn)基因小鼠的Aβ蛋白表達(dá)較低。提示Aβ蛋白

7、的蓄積需要較長(zhǎng)時(shí)間。
　　 選取行為學(xué)改變較為明顯的9月齡Tau轉(zhuǎn)基因小鼠、APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠和Tau/APP/PS1三重轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬和皮層，應(yīng)用Western-blot進(jìn)行Tau蛋白和Aβ蛋白檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tau/APP/PS1三重轉(zhuǎn)基因小鼠海馬區(qū)的Aβ蛋白表達(dá)量高出APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠34.7％，P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示在Tau/APP/PS1三重轉(zhuǎn)基因小鼠中外源Tau蛋白的表達(dá)可能影響外源Aβ蛋白的含

8、量。
　　 Western-Blot檢測(cè)9月齡的Tau/APP/PS1三重轉(zhuǎn)基因小鼠大腦海馬區(qū)、前額葉皮層、頂葉皮層和顥葉皮層的Tau蛋白和Aβ蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Aβ蛋白在海馬、前額葉皮層、頂葉皮層和顥葉皮層均有表達(dá)，前額葉皮層和項(xiàng)葉皮層Aβ蛋白含量與海馬區(qū)比較高出71.36％和84.21％，P＜0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Tau蛋白在海馬、前額葉皮層、頂葉皮層和顳葉皮層均有表達(dá)，海馬區(qū)Tau蛋白含量高出前額葉皮層24.8％、項(xiàng)葉皮

9、層24.16％、顳葉皮層25.96％。P＜0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，以上結(jié)果提示可能海馬區(qū)是發(fā)生神經(jīng)纖維纏結(jié)較早的區(qū)域，額葉皮層和頂葉皮層的可能較早發(fā)生Aβ淀粉樣沉積。
　　 Bielschowsky銀染法對(duì)小鼠進(jìn)行銀染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在9月齡時(shí)Tau轉(zhuǎn)基因小鼠和Tau/APP/PS1三轉(zhuǎn)基因小鼠的皮層和海馬部位可觀察到火焰狀或球形的神經(jīng)元纖維纏結(jié)。提示在9月齡時(shí)Tau/APP/PS1三轉(zhuǎn)基因小鼠海馬和皮層區(qū)表達(dá)神經(jīng)元纖維纏結(jié)。

10、>　　 ABC免疫組織化學(xué)法觀察各轉(zhuǎn)基因小鼠Aβ蛋白沉積所形成的老年斑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6月齡時(shí)在Tau/APP/PS1三重轉(zhuǎn)基因小鼠皮層區(qū)及APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬區(qū)和皮層區(qū)出現(xiàn)紅棕色斑塊即Aβ蛋白沉積形成的老年斑，9月齡時(shí)Tau/APP/PS1三重轉(zhuǎn)基因小鼠和APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠在海馬區(qū)和皮層區(qū)均觀察到老年斑，而野生型小鼠及Tau轉(zhuǎn)基因小鼠無(wú)此病理改變。提示Tau/APP/PS1三重轉(zhuǎn)基因小鼠Aβ沉積呈漸進(jìn)性，皮層區(qū)先出現(xiàn)由Aβ沉

11、積形成的老年斑。
　　 用Morris水迷宮進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)測(cè)定小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。6月齡時(shí)Tau/APP/PS1三重轉(zhuǎn)基因小鼠在訓(xùn)練的第1、2、3天時(shí)分別為73.49±15.94(s)、59.16±14.96(s)、47.92±15.76(s)，與Wt小鼠相比逃逸潛伏期延長(zhǎng)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05。9月齡時(shí)在第2、3、4、5天時(shí)逃逸潛伏期分別為78.45±21.33、68.43±14.58、54.35±1

12、4.58、58.43±13.26與Wt組比較潛伏期延長(zhǎng)。結(jié)果提示Tau/APP/PS1三重轉(zhuǎn)基因小鼠在6月齡時(shí)學(xué)習(xí)記憶獲得能力降低，9月齡時(shí)記憶損傷程度加深?？臻g探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)6月齡時(shí)Tau轉(zhuǎn)基因小鼠和Tau/APP/PS1三重轉(zhuǎn)基因小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)為1.8±0.58、2.0±0.54，與野生型小鼠相比穿越平臺(tái)次數(shù)減少，P＜0.05，結(jié)果有顯著性差異，提示從6月齡開(kāi)始Tau轉(zhuǎn)基因小鼠和Tau/APP/PS1三重轉(zhuǎn)基因小鼠記憶保持能力受